Úloha enzýmov a cytokínov v patogenéze osteoartrózy

V posledných rokoch sa veľká pozornosť výskumníkov sústreďuje na identifikáciu proteáz zodpovedných za degradáciu ECM kĺbovej chrupavky pri osteoartróze. Podľa moderných koncepcií hrajú matrixové metaloproteinázy (MMP) dôležitú úlohu v patogenéze osteoartrózy. U pacientov s osteoartrózou sa zisťuje zvýšená hladina troch MMP - kolagenáz, stromelyzínov a želatináz. Kolagenáza je zodpovedná za degradáciu natívneho kolagénu, stromelyzín - kolagénu typu IV, proteoglykánov a laminínu, želatináza - za degradáciu želatíny, kolagénov IV, Vh XI typov, elastínu. Okrem toho sa predpokladá prítomnosť ďalšieho enzýmu - agrekanázy, ktorá má vlastnosti MMP a je zodpovedná za proteolýzu chrupavkových proteoglykánových agregátov.

V ľudskej kĺbovej chrupavke boli identifikované tri typy kolagenáz, ktorých hladiny sú u pacientov s osteoartrózou významne zvýšené: kolagenáza-1 (MMP-1), kolagenáza-2 (MMP-8) a kolagenáza-3 (MMP-13). Koexistencia troch rôznych typov kolagenáz v kĺbovej chrupavke naznačuje, že každá z nich hrá svoju špecifickú úlohu. Kolagenázy-1 a -2 sú lokalizované hlavne v povrchovej a hornej strednej zóne kĺbovej chrupavky, zatiaľ čo kolagenáza-3 sa nachádza v dolnej strednej zóne a v hlbokej zóne. Výsledky imunohistochemickej štúdie navyše preukázali, že s progresiou osteoartrózy hladina kolagenázy-3 dosahuje plató a dokonca klesá, zatiaľ čo hladina kolagenázy-1 sa postupne zvyšuje. Existujú dôkazy o tom, že pri osteoartritíde sa kolagenáza-1 podieľa hlavne na zápalovom procese v kĺbovej chrupavke, zatiaľ čo kolagenáza-3 sa podieľa na prestavbe tkaniva. Kolagenáza-3, exprimovaná v chrupavke pacientov s osteoartrózou, degraduje kolagén typu II intenzívnejšie ako kolagenáza-1.

Zo zástupcov druhej skupiny metaloproteináz boli v ľudskom stromelyzíne identifikované aj tri: stromelyzín-1 (MMP-3), stromelyzín-2 (MMP-10) a stromelyzín-3 (MMP-11). Dnes je známe, že do patologického procesu pri osteoartróze sa zapája iba stromelyzín-1. Stromelyzín-2 sa nezistil v synoviálnej membráne pacientov s osteoartrózou, ale nachádza sa vo veľmi malých množstvách v synoviálnych fibroblastoch pacientov s reumatoidnou artritídou. Stromelyzín-3 sa nachádza aj v synoviálnej membráne pacientov s reumatoidnou artritídou v blízkosti fibroblastov, najmä vo fibróznych zónach.

V skupine želatináz v ľudskom chrupavkovom tkanive boli identifikované iba dve: 92 kD želatináza (gelatináza B alebo MMP-9) a 72 kD želatináza (gelatináza A alebo MMP-2); u pacientov s osteoartrózou sa zisťuje zvýšenie hladiny 92 kD želatinázy.

Nedávno bola identifikovaná ďalšia skupina MMP, ktoré sú lokalizované na povrchu bunkových membrán a nazývajú sa MMP membránového typu (MMP-MT). Táto skupina zahŕňa štyri enzýmy - MMP-MT1 - MMP-MT-4. Expresia MMP-MT bola zistená v ľudskej kĺbovej chrupavke. Hoci MMP-MT-1 má kolagenázové vlastnosti, oba enzýmy, MMP-MT-1 aj MMP-MT-2, sú schopné aktivovať želatinázu-72 kDa a kolagenázu-3. Úloha tejto skupiny MMP v patogenéze osteoartrózy si vyžaduje objasnenie.

Proteinázy sú vylučované vo forme zymogénu, ktorý je aktivovaný inými proteinázami alebo organickými zlúčeninami ortuti. Katalytická aktivita MMP závisí od prítomnosti zinku v aktívnej zóne enzýmu.

Biologická aktivita MMP je riadená špecifickými TIMP. Doteraz boli identifikované tri typy TIMP, ktoré sa nachádzajú v ľudských kĺbových tkanivách: TIMP-1–TIMP-3. Štvrtý typ TIMP bol identifikovaný a klonovaný, ale zatiaľ nebol v ľudských kĺbových tkanivách detegovaný. Tieto molekuly sa špecificky viažu na aktívne miesto MMP, hoci niektoré z nich sú schopné viazať sa na aktívne miesto 72 kD progelatinázy (TIMP-2, -3, -4) a 92 kD progelatinázy (TIMP-1 a -3). Dôkazy naznačujú, že pri osteoartróze existuje nerovnováha medzi MMP a TIMP v kĺbovej chrupavke, čo vedie k relatívnemu nedostatku inhibítorov, pravdepodobne čiastočne v dôsledku zvýšenia hladiny aktívnych MMP v tkanive. TIMP-1 a -2 sa nachádzajú v kĺbovej chrupavke a sú syntetizované chondrocytmi. Pri osteoartróze sa v synoviálnej membráne a synoviálnej tekutine deteguje iba TIMP typu I. TIMP-3 sa nachádza výlučne v extracelulárnom matrixe (ECM). TIMP-4 zdieľa takmer 50 % svojej aminokyselinovej sekvencie s TIMP-2 a 38 % s TIMP-1. V iných cieľových bunkách je TIMP-4 zodpovedný za moduláciu aktivácie 72 kD progelatinázy na povrchu bunky, čo naznačuje dôležitú úlohu tkanivovo špecifického regulátora remodelácie ECM.

Ďalším mechanizmom kontroly biologickej aktivity MMP je ich fyziologická aktivácia. Predpokladá sa, že enzýmy z rodiny serínových a cysteínových proteáz, ako napríklad AP/plazmín a katepsín B, sú fyziologickými aktivátormi MMP. V kĺbovej chrupavke pacientov s osteoartrózou sa zistili zvýšené hladiny urokinázy (uAP) a plazmínu.

Napriek tomu, že sa v kĺbových tkanivách nachádza niekoľko typov katepsínov, katepsín-B sa považuje za najpravdepodobnejší aktivátor MMP v chrupavke. V ľudských kĺbových tkanivách boli nájdené fyziologické inhibítory serínových a cysteínových proteáz. Aktivita inhibítora AP-1 (IAI-1), ako aj cysteínových proteáz, je u pacientov s osteoartrózou znížená. Podobne ako pri MMP/TIMP, práve nerovnováha medzi serínovými a cysteínovými proteázami a ich inhibítormi môže vysvetliť zvýšenú aktivitu MMP v kĺbovej chrupavke pacientov s osteoartrózou. Okrem toho sa MMP dokážu navzájom aktivovať. Napríklad stromelyzín-1 aktivuje kolagenázu-1, kolagenázu-3 a 92 kD želatinázu; kolagenáza-3 aktivuje 92 kD želatinázu; MMP-MT aktivuje kolagenázu-3 a želatináza-72 kDa túto aktiváciu zosilňuje; MMP-MT tiež aktivuje želatinázu 72 kDa. Cytokíny možno rozdeliť do troch skupín – deštruktívne (zápalové), regulačné (vrátane protizápalových) a anabolické (rastové faktory).

Typy cytokínov (podľa van den Berg WB et al)

Deštruktívne	Interleukín-1 TNF-a Inhibičný faktor leukémie Interleukín-17
Regulačné	Interleukín-4 Interleukín-10 Interleukín-13 Inhibítory enzýmov
Anabolický	Rastové faktory podobné inzulínu TGF-β Kostné morfogenetické proteíny Morfogenetické proteíny odvodené z chrupavky

Deštruktívne cytokíny, najmä IL-1, indukujú zvýšenie uvoľňovania proteáz a inhibujú syntézu proteoglykánov a kolagénov chondrocytmi. Regulačné cytokíny, najmä IL-4 a -10, inhibujú produkciu IL-1, zvyšujú produkciu antagonistu receptora IL-1 (IL-1RA) a znižujú hladinu NO syntázy v chondrocytoch. IL-4 teda pôsobí proti IL-1 v troch smeroch: 1) znižuje produkciu, čím zabraňuje jeho účinkom, 2) zvyšuje produkciu hlavného „zberača“ IL-1RA a 3) znižuje produkciu hlavného sekundárneho „posla“ NO. Okrem toho IL-4 znižuje enzymatickú degradáciu tkaniva. In vivo sa optimálny terapeutický účinok dosahuje kombináciou IL-4 a IL-10. Anabolické faktory, ako sú TGF-β a IGF-1, v skutočnosti neovplyvňujú produkciu alebo účinok IL-1, ale vykazujú opačnú aktivitu, napríklad stimulujú syntézu proteoglykánov a kolagénu, potláčajú aktivitu proteáz a TGF-β tiež inhibuje uvoľňovanie enzýmov a stimuluje ich inhibítory.

Prozápalové cytokíny sú zodpovedné za zvýšenú syntézu a expresiu MMP v kĺbových tkanivách. Syntetizujú sa v synoviálnej membráne a potom difundujú do kĺbovej chrupavky cez synoviálnu tekutinu. Prozápalové cytokíny aktivujú chondrocyty, ktoré sú zase schopné produkovať prozápalové cytokíny. V kĺboch postihnutých osteoartrózou zohrávajú úlohu efektora zápalu najmä bunky synoviálnej membrány. Sú to synovocyty makrofágového typu, ktoré vylučujú proteázy a zápalové mediátory. Spomedzi nich sa na patogenéze osteoartrózy najviac „podieľajú“ IL-f, TNF-a, IL-6, leukemický inhibičný faktor (LIF) a IL-17.

Biologicky aktívne látky, ktoré stimulujú degradáciu kĺbovej chrupavky pri osteoartritíde

• Interleukín-1
• Interleukín-3
• Interleukín-4
• TNF-a
• Faktory stimulujúce kolónie: makrofágy (monocyty) a granulocyty-makrofágy
• Látka P
• STRANA ₂
• Aktivátory plazminogénu (tkanivového a urokinázového typu) a plazmín
• Metaloproteinázy (kolagenázy, elastázy, stromelyzíny)
• Katepsíny A a B
• Trilsin
• Bakteriálne lipopolysacharidy
• Fosfolipáza Ag

Údaje z literatúry naznačujú, že IL-1 a pravdepodobne aj TNF-a sú hlavnými mediátormi deštrukcie kĺbového tkaniva pri osteoartróze. Zatiaľ však nie je známe, či pôsobia nezávisle od seba, alebo či medzi nimi existuje funkčná hierarchia. Zvieracie modely osteoartrózy ukázali, že blokáda IL-1 účinne zabraňuje deštrukcii kĺbovej chrupavky, zatiaľ čo blokáda TNF-a vedie iba k zníženiu zápalu v kĺbových tkanivách. Zvýšené koncentrácie oboch cytokínov boli zistené v synoviálnej membráne, synoviálnej tekutine a chrupavke pacientov. V chondrocytoch sú schopné zvýšiť syntézu nielen proteáz (hlavne MMP a AP), ale aj vedľajších kolagénov, ako sú typy I a III, a znížiť syntézu kolagénov typu II a IX a proteoglykánov. Tieto cytokíny tiež stimulujú reaktívne formy kyslíka a zápalové mediátory, ako je PGE2 _. Výsledkom takýchto makromolekulárnych zmien v kĺbovej chrupavke pri osteoartritíde je neúčinnosť reparačných procesov, čo vedie k ďalšej degradácii chrupavky.

Vyššie uvedené prozápalové cytokíny modulujú procesy supresie/aktivácie MMP pri osteoartróze. Napríklad nerovnováha medzi hladinami TIMP-1 a MMP v chrupavke pri osteoartróze môže byť sprostredkovaná IL-1, pretože štúdia in vitro preukázala, že zvýšenie koncentrácií IL-1 beta vedie k zníženiu koncentrácií TIMP-1 a zvýšeniu syntézy MMP chondrocytmi. Syntéza AP je tiež modulovaná IL-1 beta. Stimulácia chondrocytov kĺbovej chrupavky IL-1 in vitro spôsobuje od dávky závislé zvýšenie syntézy AP a prudký pokles syntézy iAP-1. Schopnosť IL-1 znižovať syntézu iAP-1 a stimulovať syntézu AP je účinným mechanizmom pre tvorbu plazmínu a aktiváciu MMP. Okrem toho plazmín nie je len enzým, ktorý aktivuje iné enzýmy, ale zúčastňuje sa aj procesu degradácie chrupavky priamou proteolýzou.

IL-ip sa syntetizuje ako neaktívny prekurzor s hmotnosťou 31 kD (pre-IL-ip) a potom sa po odštiepení signálneho peptidu premieňa na aktívny cytokín s hmotnosťou 17,5 kD. V kĺbových tkanivách, vrátane synoviálnej membrány, synoviálnej tekutiny a kĺbovej chrupavky, sa IL-ip nachádza v aktívnej forme a štúdie in vivo preukázali schopnosť synoviálnej membrány pri osteoartróze vylučovať tento cytokín. Niektoré serínové proteázy sú schopné premeniť pre-IL-ip na jeho bioaktívnu formu. U cicavcov sa takéto vlastnosti zistili iba u jednej proteázy, ktorá patrí do rodiny enzýmov špecifických pre cysteínaspartát a nazýva sa IL-1β-konvertujúci enzým (ICF alebo kaspáza-1). Tento enzým je schopný špecificky premeniť pre-IL-ip na biologicky aktívny „zrelý“ IL-ip s hmotnosťou 17,5 kD. ICF je 45 kD proenzým (p45), ktorý je lokalizovaný v bunkovej membráne. Po proteolytickom štiepení proenzýmu p45 sa vytvoria dve podjednotky známe ako p10 a p20, ktoré sa vyznačujú enzymatickou aktivitou.

TNF-a sa syntetizuje aj ako membránovo viazaný prekurzor s hmotnosťou 26 kDa; proteolytickým štiepením sa uvoľňuje z bunky ako aktívna rozpustná forma s hmotnosťou 17 kDa. Proteolytické štiepenie sa vykonáva pomocou enzýmu konvertujúceho TNF-a (TNF-AC), ktorý patrí do rodiny adamalizínov. AR Amin a kol. (1997) zistili zvýšenú expresiu mRNA TNF-AC v kĺbovej chrupavke pacientov s osteoartrózou.

Biologická aktivácia chondrocytov a synovocytov pomocou IL-1 a TNF-a je sprostredkovaná väzbou na špecifické receptory na povrchu buniek - IL-R a TNF-R. Pre každý cytokín boli identifikované dva typy receptorov - IL-IP typu I a II a TNF-R typu I (p55) a II (p75). IL-1PI a p55 sú zodpovedné za prenos signálu v bunkách kĺbového tkaniva. IL-1R typu I má mierne vyššiu afinitu k IL-1beta ako k IL-1a; IL-1R typu II má naopak vyššiu afinitu k IL-1a ako k IL-ip. Zostáva nejasné, či IL-IP typu II môže sprostredkovať signály IL-1, alebo slúži len na kompetitívnu inhibíciu asociácie IL-1 s IL-1R typu I. Chondroitidy a synoviálne fibroblasty pacientov s osteoartrózou obsahujú veľké množstvo IL-1PI a p55, čo zase vysvetľuje vysokú citlivosť týchto buniek na stimuláciu zodpovedajúcimi cytokínmi. Tento proces vedie k zvýšenému vylučovaniu proteolytických enzýmov a deštrukcii kĺbovej chrupavky.

Účasť IL-6 v patologickom procese pri osteoartritíde nemožno vylúčiť. Tento predpoklad je založený na nasledujúcich pozorovaniach:

• IL-6 zvyšuje počet zápalových buniek v synoviálnej membráne,
• IL-6 stimuluje proliferáciu chondrocytov,
• IL-6 zvyšuje účinky IL-1 pri zvyšovaní syntézy MMP a inhibícii syntézy proteoglykánov.

IL-6 je však schopný indukovať produkciu TIMP, ale neovplyvňuje produkciu MMP, preto sa predpokladá, že tento cytokín sa podieľa na procese inhibície proteolytickej degradácie kĺbovej chrupavky, ktorá sa uskutočňuje mechanizmom spätnej väzby.

Ďalším členom rodiny IL-6 je LIF, cytokín produkovaný chondrocytmi získanými od pacientov s osteoartrózou v reakcii na stimuláciu prozápalovými cytokínmi IL-1p a TNF-a. LIF stimuluje resorpciu proteoglykánov chrupavky, ako aj syntézu MMP a produkciu NO. Úloha tohto cytokínu pri osteoartróze nebola úplne objasnená.

IL-17 je homodimér s molekulovou hmotnosťou 20 – 30 kD s účinkom podobným IL-1, ale oveľa menej výrazným. IL-17 stimuluje syntézu a uvoľňovanie mnohých prozápalových cytokínov vrátane IL-1p, TNF-a, IL-6 a MMP v cieľových bunkách, ako sú ľudské makrofágy. Okrem toho IL-17 stimuluje produkciu NO chondrocytmi. Podobne ako LIF, aj úloha IL-17 v patogenéze osteoartrózy bola doteraz nedostatočne preskúmaná.

Anorganický voľný radikál NO hrá dôležitú úlohu v degradácii kĺbovej chrupavky pri osteoartritíde. Chondrocyty izolované od pacientov s osteoartrózou produkujú vyššie množstvo NO spontánne aj po stimulácii prozápalovými cytokínmi v porovnaní s normálnymi bunkami. Vysoký obsah NO bol zistený v synoviálnej tekutine a sére pacientov s osteoartrózou – je to dôsledok zvýšenej expresie a syntézy indukovanej NO syntázy (hNOC), enzýmu zodpovedného za produkciu NO. Nedávno bola klonovaná DNA hNOC špecifického pre chondrocyty a bola stanovená aminokyselinová sekvencia enzýmu. Aminokyselinová sekvencia naznačuje 50 % identitu a 70 % podobnosť s hNOC špecifickým pre endotel a nervové tkanivo.

NO inhibuje syntézu makromolekúl extracelulárnej hmoty (ECM) kĺbovej chrupavky a stimuluje syntézu MMP. Navyše, zvýšenie produkcie NO je sprevádzané znížením syntézy antagonistu IL-IP (IL-1RA) chondrocytmi. Zvýšenie hladiny IL-1 a zníženie IL-1RA teda vedie k hyperstimulácii NO v chondrocytoch, čo následne vedie k zvýšenej degradácii chrupavkovej matrice. Existujú správy o terapeutickom účinku selektívneho inhibítora hNOC in vivo na progresiu experimentálnej osteoartrózy.

Prirodzené inhibítory cytokínov sú schopné priamo zabrániť väzbe cytokínov na receptory bunkovej membrány, čím sa znižuje ich prozápalová aktivita. Prirodzené inhibítory cytokínov možno rozdeliť do troch tried na základe ich mechanizmu účinku.

Prvá trieda inhibítorov zahŕňa antagonistov receptorov, ktoré bránia väzbe ligandu na jeho receptor súťažou o väzbové miesto. Doteraz bol takýto inhibítor nájdený iba pre IL-1 - ide o vyššie spomínaný kompetitívny inhibítor systému IL-1/ILIP IL-1 PA. IL-1 PA blokuje mnohé účinky, ktoré sa pozorujú v kĺbových tkanivách pri osteoartritíde, vrátane syntézy prostaglandínov synoviálnymi bunkami, produkcie kolagenázy chondrocytmi a degradácie kostnej hmoty kĺbovej chrupavky.

IL-1RA sa nachádza v rôznych formách – jednej rozpustnej (rIL-1RA) a dvoch intercelulárnych (μIL-lPAI a μIL-1RAP). Afinita rozpustnej formy IL-1RA je 5-krát vyššia ako afinita intercelulárnych foriem. Napriek intenzívnemu vedeckému výskumu zostáva funkcia intercelulárnej formy neznáma. Experimenty in vitro ukázali, že inhibícia aktivity IL-1beta vyžaduje koncentráciu IL-1RA 10 až 100-krát vyššiu ako je normálne, zatiaľ čo podmienky in vivo vyžadujú tisícnásobné zvýšenie koncentrácie IL-1RA. Táto skutočnosť môže čiastočne vysvetliť relatívny nedostatok IL-1RA a nadbytok IL-1 v synovii pacientov s osteoartrózou.

Druhou triedou prirodzených inhibítorov cytokínov sú rozpustné cytokínové receptory. Príkladmi takýchto inhibítorov u ľudí, ktoré súvisia s patogenézou osteoartrózy, sú rIL-1R a pp55. Rozpustné cytokínové receptory sú skrátené formy normálnych receptorov; keď sa viažu na cytokíny, bránia ich väzbe na membránovo asociované receptory cieľových buniek, pričom pôsobia mechanizmom kompetitívneho antagonizmu.

Hlavným prekurzorom rozpustných receptorov je membránovo viazaný IL-1RP. Afinita rIL-IP k IL-1 a IL-1RA je odlišná. rIL-1RN má teda vyššiu afinitu k IL-1β ako k IL-1RA a rIL-1PI vykazuje vyššiu afinitu k IL-1RA ako k IL-ip.

Existujú aj dva typy rozpustných receptorov pre TNF - pp55 a pp75, podobne ako rozpustné receptory IL-1, vznikajú „uvoľňovaním“. In vivo sa oba receptory nachádzajú v tkanivách postihnutých kĺbov. Úloha rozpustných receptorov TNF v patogenéze osteoartrózy je predmetom diskusie. Predpokladá sa, že v nízkych koncentráciách stabilizujú trojrozmernú štruktúru TNF a zvyšujú polčas rozpadu bioaktívneho cytokínu, zatiaľ čo vysoké koncentrácie pp55 a pp75 môžu znižovať aktivitu TNF kompetitívnym antagonizmom. Pravdepodobne môže pp75 pôsobiť ako nosič TNF, čo uľahčuje jeho väzbu na membránovo asociovaný receptor.

Tretiu triedu prirodzených inhibítorov cytokínov predstavuje skupina protizápalových cytokínov, medzi ktoré patria TGF-beta, IL-4, IL-10 a IL-13. Protizápalové cytokíny znižujú produkciu prozápalových a niektorých proteáz a stimulujú produkciu IL-1RA a TIMP.