Molekulárno-genetické metódy na diagnostiku dedičných ochorení

Metódy DNA technológie sa používajú na určenie lokalizácie mutantného génu v konkrétnom chromozóme, ktorý je zodpovedný za vznik určitých foriem dedičnej patológie. Keďže gén je úsek DNA a génová mutácia je poškodenie primárnej štruktúry DNA (mutácia sa chápe ako všetky zmeny v sekvencii DNA bez ohľadu na ich lokalizáciu a vplyv na životaschopnosť jedinca), potom sondovaním preparátov metafázových chromozómov pacienta s dedičným ochorením je možné určiť lokalizáciu patologického génu. Molekulárne genetické metódy vytvárajú príležitosti na diagnostiku ochorení na úrovni zmenenej štruktúry DNA, umožňujú nám určiť lokalizáciu dedičných porúch. Molekulárne genetické metódy dokážu identifikovať mutácie spojené s nahradením aj jednej bázy.

Najdôležitejšou fázou identifikácie génu je jeho izolácia. DNA sa dá izolovať z akéhokoľvek typu tkaniva a buniek obsahujúcich jadrá. Fázy izolácie DNA zahŕňajú: rýchlu lýzu buniek, odstránenie fragmentov bunkových organel a membrán centrifugáciou, enzymatickú deštrukciu proteínov a ich extrakciu z roztoku pomocou fenolu a chloroformu, koncentráciu molekúl DNA precipitáciou v etanole.

V genetických laboratóriách sa DNA najčastejšie izoluje z krvných leukocytov, na čo sa pacientovi odoberie 5 – 20 ml venóznej krvi do sterilnej skúmavky s antikoagulačným roztokom (heparín). Potom sa leukocyty oddelia a spracujú podľa vyššie uvedených krokov.

Ďalšou fázou prípravy materiálu na výskum je „rozdelenie“ DNA na fragmenty v oblastiach so striktne špecifickou sekvenciou báz, ktoré sa vykonáva pomocou bakteriálnych enzýmov - reštrikčných endonukleáz (restrikčných enzýmov). Reštrikčné enzýmy rozpoznávajú špecifické sekvencie 4-6, menej často 8-12 nukleotidov v dvojvláknovej molekule DNA a delia ju na fragmenty v miestach týchto sekvencií, nazývané reštrikčné miesta. Počet výsledných reštrikčných fragmentov DNA je určený frekvenciou výskytu reštrikčných miest a veľkosť fragmentov je určená povahou rozloženia týchto miest pozdĺž dĺžky pôvodnej molekuly DNA. Čím častejšie sa reštrikčné miesta nachádzajú, tým kratšie sú fragmenty DNA po reštrikcii. V súčasnosti je známych viac ako 500 rôznych typov reštrikčných enzýmov bakteriálneho pôvodu a každý z týchto enzýmov rozpoznáva svoju vlastnú špecifickú nukleotidovú sekvenciu. V budúcnosti sa reštrikčné miesta môžu použiť ako genetické markery DNA. Fragmenty DNA vytvorené v dôsledku reštrikcie je možné zoradiť podľa dĺžky elektroforézou na agarózovom alebo polyakrylamidovom géli, a tak určiť ich molekulovú hmotnosť. DNA v géli sa typicky identifikuje špecifickým farbením (zvyčajne etídiumbromidom) a pozorovaním gélu v prechádzajúcom ultrafialovom svetle. Miesta lokalizácie DNA sú sfarbené na červeno. Avšak u ľudí, keď je DNA spracovaná niekoľkými reštrikčnými enzýmami, vzniká toľko fragmentov rôznych dĺžok, že ich nemožno oddeliť elektroforézou, t. j. nie je možné vizuálne identifikovať jednotlivé fragmenty DNA na elektroforéze (dosiahne sa rovnomerné farbenie po celej dĺžke gélu). Preto sa na identifikáciu požadovaných fragmentov DNA v takomto géli používa hybridizačná metóda so značenými DNA sondami.

Akýkoľvek jednovláknový segment DNA alebo RNA je schopný väzby (hybridizácie) s komplementárnym vláknom, pričom guanín sa vždy viaže na cytozín a adenín na tymín. Takto vzniká dvojvláknová molekula. Ak sa jednovláknová kópia klonovaného génu označí rádioaktívnou značkou, získa sa sonda. Sonda je schopná nájsť komplementárny segment DNA, ktorý sa potom ľahko identifikuje pomocou autorádiografie. Rádioaktívna sonda pridaná do preparátu natiahnutých chromozómov umožňuje lokalizáciu génu na špecifickom chromozóme: pomocou DNA sondy je možné počas Southern blottingu identifikovať špecifické oblasti. K hybridizácii dochádza, ak testovaná časť DNA obsahuje normálny gén. V prípade, že je prítomná abnormálna nukleotidová sekvencia, t. j. zodpovedajúce štruktúry chromozómu obsahujú mutantný gén, k hybridizácii nedôjde, čo umožňuje určiť lokalizáciu patologického génu.

Na získanie DNA sond sa používa metóda klonovania génov. Podstata metódy spočíva v tom, že fragment DNA zodpovedajúci génu alebo časti génu sa vloží do klonovacej častice, zvyčajne bakteriálneho plazmidu (anulárna extrachromozomálna DNA prítomná v bakteriálnych bunkách a nesúca gény rezistencie na antibiotiká), a následne sa rozmnožia baktérie s plazmidom s vloženým ľudským génom. Vďaka syntetickým procesom v plazmide je možné získať miliardy kópií ľudského génu alebo jeho časti.

Výsledné kópie DNA, označené rádioaktívnou značkou alebo fluorochrómami, sa potom používajú ako sondy na vyhľadávanie komplementárnych sekvencií v študovanej skupine molekúl DNA.

V súčasnosti existuje mnoho rôznych typov metód využívajúcich DNA sondy na diagnostiku génových mutácií.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]