Laboratórna diagnostika osteoartrózy

Vo väčšine prípadov pacienti s osteoartrózou nemajú zmeny v krvných a močových testoch, s výnimkou prípadov synovitídy s významným výpotkom, kedy sa môže vyskytnúť zvýšenie sedimentácie erytrocytov (ESR), hypergamaglobulinémia, zvýšenie hladiny ukazovateľov akútnej fázy - CRP, fibrinogénu atď. Pri vyšetrení synoviálnej tekutiny sa nezistia žiadne významné rozdiely od normálnych ukazovateľov.

V posledných rokoch sa intenzívne hľadajú možné biologické markery (BM) degradácie a reparácie kĺbových tkanív (najmä chrupavky a kosti). BM by mali odrážať tieto dynamické zmeny, slúžiť ako prediktory prognózy osteoartrózy a markery účinnosti patogenetickej liečby. Objav nových a hlbšie štúdium známych biologických markerov umožní lepšie pochopiť mechanizmy patogenézy osteoartrózy. Hlavnou úlohou využitia biologických markerov metabolizmu chrupavky je však posúdenie chondroprotektívnych vlastností liekov a monitorovanie liečby liekmi patriacimi do skupiny DMO AD – „modifikujúce ochorenie“.

Pri osteoartritíde sa patologické zmeny vyskytujú najmä v kĺbovej chrupavke, ako aj v subchondrálnej kosti, synoviálnej membráne a iných mäkkých tkanivách kĺbu. Keďže naša schopnosť priamo skúmať tieto štruktúry je obmedzená, najdôležitejšími zdrojmi pre zber biologických markerov sú krv, moč a synoviálna tekutina.

Najvhodnejší je test moču, pretože nezahŕňa žiadne invazívne zákroky. Podľa nášho názoru je ideálnym materiálom na testovanie denný moč. Vhodnejšia by bola analýza rannej porcie moču, ale možnosť jej použitia je založená len na skutočnosti, že tento typ analýzy sa používa na stanovenie biologických markerov metabolizmu kostí pri osteoporóze: je známe, že biologické markery podliehajú cirkadiánnym rytmom a maximálna koncentrácia biologických markerov metabolizmu kostí sa dosahuje v noci. V súčasnosti v literatúre nie sú žiadne informácie o cirkadiánnych rytmoch biologických markerov mäkkých tkanív a chrupavky, takže konečné rozhodnutie o výbere adekvátneho testu moču bude prijaté po vykonaní vhodných štúdií.

Krvné testy sú rutinnými klinickými testami. Niektoré biologické markery sa v krvi už stanovujú, ako napríklad indexy akútnej fázy, zatiaľ čo iné môžu byť v blízkej budúcnosti zaradené do štandardného zoznamu biochemických testov. Pre každý biologický marker je potrebné špecifikovať, v ktorej zložke krvi sa má stanoviť - v plazme alebo v sére. Výsledky výskumu naznačujú, že koncentrácia biologických markerov v krvnej plazme sa výrazne líši od koncentrácie v sére. Biologické markery sa zvyčajne stanovujú v krvnom sére. Podľa V. Rayana a kol. (1998) sú koncentrácie biologických markerov v krvi odobratej zo žily v blízkosti postihnutého kĺbu a zo vzdialenejšej žily odlišné. Tieto údaje naznačujú potrebu štandardizácie odberov krvi na štúdium biologických markerov.

Podľa LJ Attencia a kol. (1989) tvorí chrupavka synoviálnych kĺbov dospelého iba 10 % celkovej hmotnosti hyalínovej chrupavky v tele vrátane medzistavcových platničiek. Stanovenie biologických markerov v krvi a moči teda odráža skôr systémový metabolizmus ako lokálne zmeny v kĺbe postihnutom osteoartrózou. Synoviálna tekutina je pri osteoartróze najbližšie k patologickému zameraniu a pravdepodobne najpresnejšie odráža procesy prebiehajúce v postihnutom kĺbe. Koncentrácia biologických markerov v synoviálnej tekutine môže byť výrazne vyššia ako v krvi, čo znamená, že sa ľahšie určuje. Medzi príklady patrí epitop 846 agrekánu - v synoviálnej tekutine je ho 40-krát viac ako v krvnom sére, proteíny oligomérnej matrice chrupavky (COMP) - 10-krát viac ako v krvnom sére. Produkty degradácie v synoviálnej tekutine presnejšie odrážajú katabolické procesy v kĺbovej chrupavke. Odtok molekúl zo synoviálnej tekutiny lokálnym lymfatickým systémom môže viesť k zmenšeniu ich veľkosti a dokonca k ich deštrukcii.

Napriek invazívnosti techniky odberu synoviálnej tekutiny, spojenej s množstvom možných komplikácií, je hodnota stanovenia biologických markerov v nej zrejmá. Aby sa predišlo problémom s tzv. suchým kĺbom, je možné bezprostredne pred odberom tekutiny vstreknúť do kĺbu 20 ml izotonického roztoku NaCl. Bezprostredne po injekcii izotonického roztoku by mal pacient 10-krát ohnúť a natiahnuť končatinu v kĺbe, po čom by mala nasledovať rýchla aspirácia zriedenej synoviálnej tekutiny. Podľa EM-JA Thonara (2000) takéto zriedenie synoviálnej tekutiny ovplyvňuje metabolizmus v kĺbovej chrupavke. Výsledky štúdie FC Robiona a kol. (2001) však naznačujú, že opakovaná laváž kolenných kĺbov koní nespôsobuje významné zmeny v metabolizme chrupavky. Tieto údaje si určite vyžadujú potvrdenie. Preto sa pre každý biologický marker musí v štádiu predklinických štúdií na zvieratách stanoviť vplyv laváže kĺbu na zmeny jeho koncentrácie.

Ďalším dôležitým bodom je stanovenie polčasu rozpadu v synoviálnej tekutine a krvi pre každý biologický marker. Bez takýchto údajov bude interpretácia výsledkov testov náročná. Polčas rozpadu biologicky aktívnych látok v krvi je zvyčajne kratší ako v iných kvapalných médiách kvôli účinnému klírensu pečeňou a obličkami. Preto je pre každý biologický marker potrebné určiť aj eliminačnú dráhu. N-propeptid kolagénu typu III sa teda vylučuje pečeňou endocytózou sprostredkovanou receptormi a neglykozylované fragmenty kolagénu sa vylučujú hlavne močom, rovnako ako osteokalcín. Na endotelových bunkách dutín pečeňových lalokov sa nachádzajú receptory pre glykozaminoglykány, takže kyselina hyalurónová a proteoglykány sa vylučujú pečeňou. Polčas rozpadu kyseliny hyalurónovej v krvi je 2 – 5 minút. Prítomnosť synovitídy môže urýchliť klírens biologických markerov z kĺbov, hoci štúdia na králikoch nezistila žiadne významné rozdiely v klírense proteoglykánov so synovitídou alebo bez nej. Preto je potrebné preskúmať vplyv zápalu na zmeny koncentrácie biologických markerov v telesných tekutinách.

Obličky selektívne filtrujú biologické markery. Glykozaminoglykány, ktoré nesú veľký negatívny náboj, teda nemusia preniknúť cez bazálnu membránu obličiek, zatiaľ čo glykozaminoglykány, ako je chondroitín-6-sulfát a chondroitín-4-sulfát, sú v moči detekovateľné.

Okrem patológie (najmä osteoartrózy) môže koncentráciu biologických markerov v telesných tekutinách ovplyvniť množstvo faktorov:

1. Cirkadiánne rytmy boli študované len pre malý počet biologických markerov. Boli študované pre markery metabolizmu kostí. Vrchol koncentrácie osteokalcínu sa teda vyskytuje v noci a kolagénových zosieťovaní ráno - o 8:00. Pri reumatoidnej artritíde sa vrchol aktivity IL-6 tiež vyskytuje v noci (približne o 14:00) a skôr ako u osteokalcínu. Tieto údaje sú zaujímavé v súvislosti s účasťou IL-6 na zápale a fyziológii kostného tkaniva. TNF-a naopak nemá cirkadiánne rytmy. Receptory tohto cytokínu sa im však môžu podriadiť.
2. Peristaltika. Kyselinu hyalurónovú syntetizujú synoviálne bunky (rovnako ako mnoho iných buniek) a je potenciálnym markerom synovitídy pri osteoartritíde a reumatoidnej artritíde. Najvyššia koncentrácia hyaluronátu sa však nachádza v črevnom lymfatickom systéme. Nie je prekvapujúce, že koncentrácia cirkulujúcej kyseliny hyalurónovej sa môže po jedle zvýšiť. Preto by sa odber krvi na stanovenie biologických markerov mal vykonávať nalačno alebo 3 hodiny po jedle. A vplyv peristaltiky na hladinu biologických markerov v krvi si vyžaduje štúdium.
3. Fyzická aktivita ráno po spánku vedie u zdravých jedincov k zvýšeniu koncentrácie kyseliny hyalurónovej v krvi, MMP-3 a epitopu keratansulfátu. Fyzická aktivita môže zmeniť koncentráciu niektorých markerov v synoviálnej tekutine aj v krvnom sére. Takéto zvýšenie je výraznejšie u pacientov s reumatoidnou artritídou, navyše koncentrácia biologických markerov koreluje s klinickým stavom týchto pacientov.
4. Ochorenia pečene a obličiek. Cirhóza pečene spôsobuje významné zvýšenie hladín kyseliny hyalurónovej v sére a pravdepodobne ovplyvňuje elimináciu proteoglykánov. Je známe, že ochorenia obličiek ovplyvňujú koncentrácie osteokalcínu. Táto problematika si tiež vyžaduje hlbšie štúdium.
5. Vek a pohlavie. Počas rastu sa zvyšuje aktivita buniek rastovej platničky, čo je sprevádzané zvýšením koncentrácie skeletálnych biologických markerov v krvnom sére. Príkladom je zvýšenie koncentrácie fragmentov agrekánu a kolagénu typu II v periférnej krvi a moči rastúcich zvierat. Interpretácia analýz biologických markerov u detí a dospievajúcich s ochoreniami pohybového aparátu je preto náročná. Pri mnohých biologických markeroch sa zistilo zvýšenie koncentrácie so starnutím. U mužov koncentrácia biologických markerov v chrupavkovom a kostnom tkanive výrazne prevyšuje koncentráciu u žien. Okrem toho u žien v menopauze a postmenopauze možno očakávať zmeny v koncentrácii biologických markerov metabolizmu chrupavky, podobné tým, ktoré sa pozorujú v kostnom tkanive.
6. Chirurgické zákroky môžu tiež ovplyvniť hladiny biologických markerov a tento účinok môže pretrvávať niekoľko týždňov.

Koncept biologických markerov osteoartrózy je založený na predpoklade, že odrážajú určité aspekty metabolických procesov v kĺbových tkanivách. Vzťah medzi koncentráciami biologických markerov v telesných tekutinách a metabolizmom chrupavky, synoviálnej membrány a iných tkanív sa však ukázal ako veľmi zložitý.

Napríklad koncentrácia markerov degradácie ECM kĺbovej chrupavky v synoviálnej tekutine môže závisieť nielen od stupňa degradácie samotnej matrice, ale aj od iných faktorov, ako je stupeň eliminácie molekulárnych fragmentov zo synovie, ktorý už bol spomenutý vyššie, ako aj od množstva chrupavkového tkaniva zostávajúceho v kĺbe.

Napriek vyššie uvedeným skutočnostiam koncentrácia biologických markerov v synoviálnej tekutine vo všeobecnosti koreluje s metabolizmom molekúl ECM kĺbovej chrupavky. Napríklad zmeny v koncentrácii fragmentov agrekánu, epitopu 846, COMB a C-propeptidu kolagénu II v synoviálnej tekutine po poranení kĺbu a počas rozvoja osteoartrózy sú v súlade so zmenami v intenzite metabolizmu agrekánu, COMB a kolagénu II v experimentálnych modeloch osteoartrózy u zvierat/a in vivo a v kĺbovej chrupavke pacientov s osteoartrózou/a in vitro.

Identifikácia špecifických zdrojov molekulárnych fragmentov je zložitý proces. Zvýšené uvoľňovanie molekulárnych fragmentov môže nastať jednak v dôsledku všeobecného zvýšenia degradačných procesov, ktoré nie sú kompenzované syntetickými procesmi, a jednak v dôsledku zvýšenej degradácie so súčasným zvýšením intenzity syntézy rovnakých molekúl ECM; v druhom prípade sa koncentrácia molekúl ECM nemení. Preto je potrebné hľadať markery špecifické pre degradáciu a syntézu. Príkladom prvého sú fragmenty agrekánu a druhého je C-propeptid kolagénu 11.

Aj keď je biologický marker spojený so špecifickým aspektom metabolizmu, je potrebné zohľadniť špecifické črty tohto procesu. Napríklad identifikované fragmenty môžu vzniknúť v dôsledku degradácie de novo syntetizovanej molekuly, ktorá sa ešte neintegrovala do funkčného ECM, molekuly, ktorá sa práve integrovala do ECM, a nakoniec permanentnej molekuly ECM, ktorá je dôležitou funkčnou súčasťou zrelej matrice. Ďalším problémom je definícia špecifickej zóny matrice (pericelulárna, teritoriálna a interteritoriálna matrica), ktorá slúžila ako zdroj biologických markerov detegovaných v synoviálnej tekutine, krvi alebo moči. Štúdie in vitro naznačujú, že intenzita metabolizmu v jednotlivých zónach ECM kĺbovej chrupavky môže byť odlišná. Štúdium určitých epitopov spojených so sulfáciou chondroitínsulfátu môže pomôcť identifikovať populáciu de novo syntetizovaných molekúl agrekánu.

Dá sa predpokladať, že výskyt fragmentov molekúl normálne prítomných v chrupavkovej extracelulárnej membráne (ECM) v synoviálnej tekutine súvisí s metabolizmom chrupavkovej matrice. Nie je to však vždy tak, pretože to závisí od viacerých faktorov, najmä od toho, o koľko koncentrácia danej molekuly v kĺbovej chrupavke prevyšuje koncentráciu v iných kĺbových tkanivách a o koľko intenzita jej metabolizmu v chrupavke prevyšuje intenzitu v iných kĺbových tkanivách. Celková hmotnosť agrekánu v kĺbovej chrupavke teda výrazne prevyšuje hmotnosť napríklad v menisku kolenného kĺbu, zatiaľ čo celková hmotnosť COMB v menisku sa prakticky nelíši od hmotnosti v kĺbovej chrupavke. Stromelyzín-1 produkujú chondrocyty aj synovocyty, ale celkový počet buniek v synoviálnej membráne prevyšuje počet buniek v chrupavke, takže významná časť stromelyzínu-1 nachádzajúceho sa v synoviálnej tekutine je s najväčšou pravdepodobnosťou synoviálneho pôvodu. Identifikácia špecifického zdroja biologických markerov je preto mimoriadne náročná a často nemožná.

Pri štúdiu biologických markerov v krvnom sére a moči vzniká problém určenia ich možného extraartikulárneho zdroja. Okrem toho sa v prípade monoartikulárneho poškodenia biologické markery vylučované postihnutým kĺbom môžu miešať s markermi vylučovanými intaktnými kĺbmi vrátane kontralaterálnych. Kĺbová chrupavka tvorí menej ako 10 % celkovej hmotnosti hyalínovej chrupavky v tele. Stanovenie biologických markerov v krvi a moči môže byť preto opodstatnené skôr pri polyartikulárnych alebo systémových ochoreniach (v súvislosti s osteoartrózou - pri generalizovanej osteoartróze).

Požiadavky na biologické markery závisia od toho, či sa používajú ako diagnostický, prognostický alebo hodnotiaci test. Napríklad diagnostický test určuje rozdiely medzi zdravými jedincami a pacientmi s osteoartrózou, čo sa vyjadruje z hľadiska citlivosti a špecifickosti testu. Prognostický test identifikuje jedincov v kohorte, u ktorých je najpravdepodobnejšie, že ochorenie rýchlo progreduje. Nakoniec, hodnotiaci test je založený na schopnosti markera monitorovať zmeny v priebehu času u jednotlivého pacienta. Okrem toho sa biologické markery môžu použiť na určenie citlivosti pacientov na konkrétny liek.

Spočiatku sa predpokladalo, že biologické markery by mohli slúžiť ako diagnostické testy, ktoré by pomohli rozlíšiť kĺb postihnutý osteoartrózou od intaktného kĺbu, ako aj vykonať diferenciálnu diagnostiku s inými ochoreniami kĺbov. Preto sa stanovenie koncentrácie keratansulfátu v krvnom sére považovalo za diagnostický test generalizovanej osteoartózy. Následné štúdie však ukázali, že tento biologický marker môže v niektorých situáciách odrážať degradáciu chrupavkových proteoglykánov. Ukázalo sa, že koncentrácie biologických markerov v krvnom sére závisia od veku a pohlavia vyšetrovanej osoby.

Predpokladané biologické markery metabolizmu kĺbového tkaniva v synoviálnej tekutine a krvnom sére pacientov s osteoartrózou

Biologický marker	Proces	V synoviálnej tekutine (odkazy)	V krvnom sére (odkazy)
1. Chrupavka
Aggrecan
Fragmenty jadrových proteínov	Degradácia agrekánov	Lohmander LS. a kol., 1989; 1993	Thonar EJMA a kol., 1985; Campion GV a kol., 1989; MehrabanF. a kol., 1991; Spector TD a kol., 1992; Lohmander LS., Thonar EJ-MA, 1994; Poole AR a kol., 1994) t (Poole AR a kol., 1994)
Epitopy jadrových proteínov (neoepitopy špecifické pre zónu štiepenia)	Degradácia agrekánov	Sandy JD a kol., 1992; LohmanderLS. a kol., 1993; LarkM.W. a kol., 1997
Epitopy keratonických sulfátov	Degradácia agrekánov	Campion GV a kol., 1989; Belcher C a kol., 1997
Epitopy chondroitínsulfátov (846, ЗВЗ, 7D4 a DR.)	Syntéza/degradácia agrekánov	Poole AR a kol., 1994; HazellP.K. a kol., 1995; Slater RR Jr. a kol., 1995; Plaas AHK a kol., 1997; 1998; Lohmander LS. a kol., 1998
Pomer chondroitín-6 a chondroitín-4 sulfátov	Syntéza/degradácia agrekánov	Shinme i. M. a kol. 1993
Malé proteoglykány	Degradácia malých proteoglykánov	Witsch-PrehmP. a kol., 1992
Matricové proteíny chrupavky
HOMP	Degradácia HOMP	Saxne T., Heinegerd D., 1992"; LohmanderLS. a kol., 1994; Petersson IF a kol., 1997	Šarif M. a kol., 1995
Chrupavkové kolagény
C-propeptid kolagénu typu II	Syntéza kolagénu II	ShinmeiM. a kol., 1993; YoshiharaY. a kol., 1995; LohmanderLS. a kol., 1996
Fragmenty alfa reťazca kolagénu typu II	Degradácia kolagénu II	Hollander AP a kol., 1994; Billinghurst RC a kol., 1997; AtleyLM. a kol., 1998
MMP a ich inhibítory	Syntéza a sekrécia	Zo synoviálnej membrány alebo kĺbovej chrupavky?
II. Menisky
HOMP	Degradácia HOMP	Z kĺbovej chrupavky, menisku alebo synovie?
Malé proteoglykány	Degradácia malých proteoglykánov
III. Synoviálna membrána
Kyselina hyalurónová	Syntéza kyseliny hyalurónovej		Goldberg RL a kol., 1991; Hedin P.-J. a kol., 1991; Sharif M. a kol., 1995
MMP a ich inhibítory
Stromelyzín (MMP-3)	Syntéza a sekrécia MMP-3	LohmanerLS a kol., 1993	ZuckerS. a kol., 1994; YoshiharaY. a kol., 1995
Intersticiálna kolagenáza (MMP-1)	Syntéza a sekrécia MMP-1	Clark IM a kol., 1993; LohmanderLS a kol., 1993	Manicourt DH a kol., 1994
TIMP	Syntéza a sekrécia TIMP	Lohmander LS. a kol., 1993; Manicourt DH a kol., 1994	Yoshihara Y. a kol., 1995
N-propeptid kolagénu typu III	Syntéza/degradácia kolagénu III	Šaríf M. a kol., 1996	Šaríf M. a kol., 1996

Množstvo štúdií preukázalo rozdiely v koncentráciách agrekánových fragmentov, HOMP a MMP a ich inhibítorov v kĺbovej tekutine kolenných kĺbov zdravých dobrovoľníkov, pacientov s reumatoidnou artritídou, reaktívnou artritídou alebo osteoartrózou. Napriek tomu, že autori preukazujú významné rozdiely v priemerných koncentráciách biologických markerov, interpretácia údajov je náročná, pretože porovnávacia analýza bola profilová a retrospektívna. Prognostické vlastnosti týchto testov je potrebné potvrdiť v prospektívnych štúdiách.

Biologické markery možno použiť na posúdenie závažnosti ochorenia alebo štádia patologického procesu. V prípade osteoartrózy sa závažnosť ochorenia a jeho štádiá posudzujú na základe výsledkov röntgenových vyšetrení, artroskopie, ako aj na základe závažnosti syndrómu bolesti, obmedzenia funkcie postihnutých kĺbov a funkčnej kapacity pacienta. L. Dahlberg a kol. (1992) a T. Saxne a D. Heinegard (1992) navrhli použiť niektoré molekulárne markery metabolizmu kĺbovej chrupavky na ďalšiu charakterizáciu štádií osteoartrózy. Na zavedenie takýchto biologických markerov do lekárskej praxe je však potrebný ďalší výskum v tomto smere.

Existujú správy o možnom použití biologických markerov ako prognostických testov. Napríklad sa ukázalo, že koncentrácia kyseliny hyalurónovej (ale nie keratansulfátu) v sére pacientov s osteoartrózou kolena na začiatku štúdie naznačuje progresiu gonartrózy počas 5 rokov pozorovania. V rovnakej populácii pacientov sa ukázalo, že zvýšený obsah COMB v sére pacientov s gonartrózou počas prvého roka po začiatku štúdie bol spojený s rádiografickou progresiou počas 5 rokov pozorovania. Štúdie biologických markerov u pacientov s reumatoidnou artritídou ukázali, že koncentrácia COMB, epitopu 846, chondroitínsulfátu v sére je spojená s rýchlejšou progresiou ochorenia. Tieto výsledky, získané v malých skupinách pacientov, často nepreukazujú silu vzťahu medzi hladinou biologických markerov a progresiou ochorenia, t. j. sú potrebné ďalšie štúdie, prospektívne a na väčších kohortách pacientov.

TD Spector a kol. (1997) zistili mierne zvýšenie sérového CRP u pacientov s včasnou osteoartrózou a uviedli, že CRP môže byť prediktorom progresie osteoartrózy. V tomto prípade zvýšenie CRP odráža procesy poškodenia kĺbového tkaniva a môže byť spojené so zvýšením kyseliny hyalurónovej, čo tiež naznačuje progresiu ochorenia. Je možné, že synoviálna membrána je zodpovedná za väčšinu kyseliny hyalurónovej stanovenej v sére, čo naznačuje prítomnosť miernej synovitídy. Zvýšené koncentrácie stromelyzínu MMP v synoviálnej tekutine a sére pacientov s osteoartrózou a po poranení kĺbu môžu byť tiež spojené s miernou synovitídou.

Biologické markery sa nakoniec môžu použiť ako kritériá účinnosti v klinických skúškach liekov, ako aj na monitorovanie patogenetickej liečby. Existujú však dva vzájomne súvisiace problémy: nedostatok liekov s preukázanými vlastnosťami „modifikujúcimi štruktúru“ alebo „modifikujúcimi ochorenie“ je do značnej miery spôsobený nedostatkom spoľahlivých biologických markerov a naopak, nedostatok špecifických markerov metabolizmu kĺbového tkaniva je do značnej miery spôsobený nedostatkom kontrolovaných štúdií liekov v týchto skupinách.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]