Imunologické štúdie v urológii

Predpísanie imunogramu urologickému pacientovi znamená, že ošetrujúci lekár má podozrenie na prítomnosť porúch v imunitnom systéme. Opakujúce sa bakteriálne, vírusové, plesňové infekcie, alergické prejavy, systémové ochorenia môžu byť príznakmi týchto porúch, ktoré sú charakterizované množstvom syndrómov (infekčný, onkologický, alergický, autoimunitný, lymfoproliferatívny). Jeden pacient môže mať niekoľko syndrómov. Napríklad chronické infekčné ochorenia (infekčný syndróm) môžu spôsobiť imunodeficienciu a imunodeficiencia sa môže prejaviť ako predispozícia k infekčným a onkologickým ochoreniam (onkologický syndróm). Predispozícia k infekciám sa môže vyskytnúť na pozadí sekundárnej imunodeficiencie, ktorá sa vyvinula v dôsledku lymfoproliferatívneho ochorenia, ako je leukémia. Existujú tri hlavné skupiny patologických zmien v imunitnom systéme:

• kvantitatívny alebo funkčný deficit jednej alebo druhej väzby imunitného systému, ktorý vedie k rozvoju stavu imunodeficiencie;
• porucha rozpoznávania antigénov imunitným systémom, čo vedie k rozvoju autoimunitných procesov;
• hyperreaktívna alebo „zvrátená“ imunitná odpoveď, ktorá sa prejavuje rozvojom alergických ochorení.

Existujú skríningové (testy úrovne 1) a objasňujúce (testy úrovne 2) metódy imunodiagnostiky. Prvé existujú na zaznamenávanie porúch v imunitnom systéme, druhé na stanovenie mechanizmov zapojených do ich implementácie s cieľom ďalšej imunokorekcie.

B-bunková imunita

Skríningové metódy

• Stanovenie relatívneho a absolútneho počtu B-lymfocytov pomocou imunofluorescencie alebo prietokovej cytofluorometrie s monoklonálnymi protilátkami proti antigénom B-buniek (CD19, CD20, kde CD sú zhluky diferenciácie). Normálny obsah B-lymfocytov u dospelých je 8 – 19 % z celkového počtu leukocytov alebo 190 – 380 buniek/μl. Zvýšenie obsahu B-lymfocytov sa vyskytuje pri akútnych a chronických bakteriálnych a plesňových infekciách, chronických ochoreniach pečene, systémových ochoreniach spojivového tkaniva, chronickej lymfocytovej leukémii a myelóme.
• Stanovenie koncentrácie nešpecifických imunoglobulínov (F, M, G, E) jednoduchou radiálnou imunodifúziou, nefelometriou alebo turbometriou, rádioimunoanalýzou alebo enzýmovým imunotestom (ELISA). Normy pre dospelých: imunoglobulín (Ig) A 0,9-4,5 g/l. IgM 03-3,7 g/l. IgG 8,0-17 g/l. Zvýšenie koncentrácie imunoglobulínov sa vyskytuje pri rovnakých patologických stavoch, pri ktorých dochádza k zvýšeniu obsahu B-lymfocytov. Zníženie koncentrácie imunoglobulínov sa vyskytuje pri vrodenej hypogamaglobulinémii, novotvaroch imunitného systému, odstránení sleziny, strate bielkovín, ochoreniach obličiek alebo čriev, liečbe cytostatikami a imunosupresívami.

Metódy objasňovania

• Stanovenie cirkulujúcich imunitných komplexov v krvi selektívnym precipitačným testom v polyetylénglykole s následným spektrofotometrickým stanovením hustoty (normálne 80-20 U). Zvýšenie cirkulujúcich imunitných komplexov je typické pre akútne bakteriálne, plesňové, vírusové infekcie, autoimunitné ochorenia, ochorenia spôsobené imunokomplexmi, sérovú chorobu, alergické reakcie typu 3;
• Stanovenie špecifických imunoglobulínov v krvi vo vzťahu k bakteriálnym a vírusovým antigénom, deoxyribonukleovej kyseline (DNA) pri autoimunitných ochoreniach, detekcia antispermových (autoimunitná neplodnosť) a antirenálnych protilátok (pyelonefritída a glomerulonefritída) radiálnou imunodifúziou alebo metódou ELISA.
• Stanovenie antispermových protilátok v spermiách [MAR test (zmiešaná antiglobulínová reakcia)], normálny - negatívny výsledok.
• Stanovenie koncentrácie imunoglobulínov v moči na účely diferenciálnej diagnostiky medzi pyelonefritídou a glomerulonefritídou (selektivita proteinúrie).
• Stanovenie obsahu IgE v prostatickej šťave na účely diagnostiky alergickej prostatitídy pomocou radiálnej imunodifúznej metódy alebo ELISA.
• Štúdia odpovede v reakcii blastickej transformácie B-lymfocytov na mitogén B-buniek (mitogén z líčidla líčieho na stimuláciu reakcie blastickej transformácie B-lymfocytov v prítomnosti T-lymfocytov), ktorého normatívna hodnota je 95 – 100 %.

T-bunková imunita

Skríningové metódy

• Stanovenie relatívneho a absolútneho počtu zrelých CD3 T-lymfocytov imunofluorescenčnou reakciou alebo prietokovou cytofluorometriou s použitím monoklonálnych protilátok proti CD3. Norma pre dospelých je 58-76% alebo 1100-1700 buniek/μl. Pokles počtu T-lymfocytov je indikátorom nedostatočnosti bunkovej imunity. To je typické pre niektoré sekundárne a primárne imunodeficiencie (chronické bakteriálne a vírusové infekcie: tuberkulóza, syndróm získanej imunodeficiencie, zhubné nádory, chronické zlyhanie obličiek, úrazy, stres, starnutie, podvýživa, liečba cytostatikami, vystavenie ionizujúcemu žiareniu). Zvýšenie počtu T-lymfocytov nastáva na pozadí imunitnej hyperaktivity alebo pri lymfoproliferatívnych ochoreniach. Pri zápale sa počet T-lymfocytov najprv zvyšuje a potom klesá. Absencia poklesu T-lymfocytov naznačuje chronický zápalový proces.
• Vyhodnotenie subpopulácií lymfocytov.
  • Stanovenie počtu T-helperov (protilátky proti CD4). Normálne 36-55% alebo 400-1100 buniek/mcl. Zvýšenie počtu týchto buniek sa vyskytuje pri autoimunitných ochoreniach, Waldenstromovej chorobe, aktivácii protitransplantačnej imunity; zníženie počtu T-helperov sa vyskytuje pri chronických bakteriálnych, vírusových, protozoálnych infekciách, tuberkulóze, syndróme získanej imunodeficiencie, malígnych nádoroch, popáleninách, úrazoch, podvýžive, starnutí, liečbe cytostatikami, vystavení ionizujúcemu žiareniu.
  • Stanovenie počtu T-supresorov (protilátok proti CD4). Normálne 17-37% alebo 300-700 buniek/μl. Zvýšenie počtu T-supresorov nastáva za rovnakých podmienok, za ktorých sa počet T-pomocníkov znižuje, a ich zníženie nastáva za rovnakých podmienok, za ktorých sa obsah T-pomocníkov zvyšuje.
  • Imunoregulačný index CD4/CD8, normálne 1,5-2,5. Hyperaktivita s hodnotami nad 2,5 (alergické a autoimunitné ochorenia); hypoaktivita - menej ako 1,0 (predispozícia k chronickým infekciám). Na začiatku zápalového procesu sa imunoregulačný index zvyšuje a po jeho ústupe sa normalizuje.

Metódy objasňovania

• Stanovenie počtu prirodzených zabíjačov (NK buniek) - protilátok proti CD16 a CD56. Norma pre CD 16 lymfocyty je 6-26%, CD56 - 9-19%. Zvýšenie počtu NK buniek nastáva počas odmietnutia transplantátu, zníženie - pri vírusových infekciách, rakovine, primárnych a sekundárnych imunodeficienciách, popáleninách, poraneniach a strese, liečbe cytostatikami a vystavení ionizujúcemu žiareniu.
• Stanovenie počtu T-lymfocytov s receptorom pre interleukín-2 (aktivačný marker) - protilátky proti CD25. Norma je 10-15%. Zvýšenie ich počtu sa pozoruje pri alergických ochoreniach, odmietnutí transplantátu, odpovedi na antigény závislé od týmusu v akútnom období primárnej infekcie, zníženie - pri rovnakých ochoreniach, pri ktorých dochádza k zníženiu počtu NK buniek.
• Štúdium expresie aktivačného markera - molekuly histokompatibility triedy II HLA-DR. Zvýšená expresia sa vyskytuje pri zápalových procesoch, u pacientov s hepatitídou C, celiakiou, syfilisom, akútnymi respiračnými ochoreniami.
• Hodnotenie apoptózy lymfocytov. Hrubú predstavu o pripravenosti lymfocytov na apoptózu možno určiť expresiou receptora Fas (CD95) na ich povrchu a protoonkogénu bd-2 v mitochondriách. Apoptóza lymfocytov sa hodnotí ich ošetrením dvoma fluorescenčnými farbivami: propídiumjodidom, ktorý sa viaže na fragmenty DNA, a anexínom Y, ktorý sa viaže na fosfatidylserín, ktorý sa objavuje na bunkovej membráne na začiatku apoptózy. Výsledky sa vyhodnocujú pomocou prietokového cytofluorometra. Výsledky sa vypočítavajú na základe pomeru buniek zafarbených rôznymi farbivami. Nezafarbené bunky sú životaschopné, bunky viazané iba na anexín Y sú skorými prejavmi apoptózy, pričom propídiumjodid a anexín Y sú neskorými prejavmi apoptózy, farbenie iba propídiumjodidom naznačuje nekrózu.
• Hodnotenie proliferácie T-lymfocytov in vitro.
  • Zmeny v bunkovej blastogenéze - blastová transformačná reakcia lymfocytov. Leukocyty sa inkubujú s akýmkoľvek mitogénom rastlinného pôvodu (lektíny). Fytohemaglutinín sa najčastejšie používa 72 hodín, potom sa odoberie ster, zafarbí a spočíta sa počet blastov! Stimulačný index je pomer percenta transformovaných buniek v experimente (kultúra s fytohemaglutinínom) k percentu transformovaných buniek v kontrole (kultúra bez fytohemaglutinínu). Blastovú transformačnú reakciu lymfocytov možno posúdiť pridaním rádioaktívnej značky (ZN-tymndinum) do kultivovaných buniek, pretože syntéza DNA sa počas bunkového delenia zvyšuje. Poruchy proliferatívnej odpovede sa vyskytujú pri primárnych aj sekundárnych imunodeficienciách spojených s infekciami, rakovinou, zlyhaním obličiek a chirurgickými zákrokmi.
  • V týchto štúdiách sa hodnotí expresia aktivačných markerov (CD25, transferínový receptor - CD71) a molekuly hlavného histokompatibilného komplexu triedy II HLA-DR, ktoré na pokojových T-lymfocytoch prakticky chýbajú. T-lymfocyty sa stimulujú fytohemaglutinínom, po 3 dňoch sa expresia aktivačných markerov analyzuje metódou priamej alebo nepriamej imunofluorescenčnej reakcie, prietokovou cytofluorometriou, s použitím monoklonálnych protilátok proti izolovaným receptorom.
  • Meranie množstva mediátorov syntetizovaných aktivovanými T-lymfocytmi [interleukín (IL) 2, IL-4, IL-5, IL-6, γ-interferón atď.] pomocou rádioimunoanalýzy alebo ELISA. Obzvlášť dôležité je stanovenie koncentrácie γ-interferónu a IL-4 ako markerov Th1 a Th2 v supernatante aktivovaných kultúr a vo vnútri bunky. Ak je to možné, je užitočné určiť génovú expresiu pre zodpovedajúci cytokín pomocou hladiny ribonukleovej kyseliny v matrixe v produkčnej bunke a intenzity expresie receptorov pre zodpovedajúce cytokíny.
    
• Reakcia inhibície migrácie lymfocytov. Senzitizované T-lymfocyty v reakcii s antigénom vylučujú lymfokíny vrátane faktorov inhibujúcich migráciu lymfocytov. Inhibičný jav sa pozoruje po zavedení mitogénov do bunkovej kultúry. Vyhodnotenie stupňa inhibície nám umožňuje posúdiť schopnosť lymfocytov vylučovať cytokíny. Frekvencia migrácie je zvyčajne v závislosti od konkrétneho mitogénu 20 – 80 %.
• Posúdenie cytotoxicity NK buniek. Stanovuje sa schopnosť prirodzených zabíjačských buniek zabíjať cieľové bunky erytromyeloidnej línie K-562. Ak sa hodnotí cytotoxicita závislá od protilátok, používajú sa cieľové bunky potiahnuté protilátkami IgG. Cieľové bunky sa označia 3H-uridínom a inkubujú sa s efektorovými bunkami. Smrť cieľových buniek sa hodnotí uvoľnením rádioaktívnej značky do roztoku. Pokles cytotoxicity nastáva pri malígnych novotvaroch. V niektorých prípadoch, keď je potrebné predpovedať účinnosť liečby interleukínmi, sa cytotoxicita NK buniek hodnotí počas inkubácie s určitými cytokínmi.

Štúdium funkcie fagocytov

Skríningové metódy

Štúdium intenzity absorpcie mikrobiálnych buniek fagocytmi (fagocytóza latexových častíc, testovacia kultúra stafylokokov, E. coli alebo mikroorganizmov izolovaných od pacienta). Centrifugáciou heparinizovanej krvi sa izoluje suspenzia leukocytov, pridá sa sérum IV. krvnej skupiny na opsonizáciu (opsoníny sú proteíny, ktoré zvyšujú fagocytózu). Mikrobiálna suspenzia sa zriedi, zmieša s leukocytmi a inkubuje sa 120 minút, pričom vzorky na analýzu sa odoberú 30,90,120 minút po začiatku inkubácie. Z odobratej suspenzie leukocytov sa urobia nátery. Stanovujú sa nasledujúce ukazovatele fagocytózy:

• fagocytárny index - percento buniek, ktoré vstúpili do fagocytózy do 30 minút a 120 minút inkubácie; štandardná hodnota fagocytárneho indexu (30) je 94 %, fagocytárny index (120) je 92 %;
• fagocytárne číslo - priemerný počet baktérií nachádzajúcich sa intracelulárne; štandardná hodnota fagocytárneho čísla (30) je 11 %, fagocytárne číslo (120) je 9,8 %;
• koeficient fagocytového počtu - pomer fagocytového počtu (30) k fagocytovému počtu (120); normálne 1,16;
• Baktericídny index neutrofilov - pomer počtu mikróbov usmrtených vo fagocytoch k celkovému počtu absorbovaných mikróbov; normálne 66 %.

Metódy objasňovania

• Štúdium baktericídnej schopnosti fagocytov v teste s nitromodrou tetrazoliovou (NBT) - NBT test. K leukocytom sa pridá žlté farbivo nitromodrá tetrazoliová. Keď neutrofil absorbuje farbivo, dochádza k redukčnému procesu pod vplyvom voľných kyslíkových radikálov, čoho výsledkom je modré sfarbenie. Reakcia sa vykonáva v 96-jamkovej platni s plochým dnom. Do prvých troch jamiek so zmesou NBT a leukocytov sa pridá Hanksov roztok (spontánna NBT) a do druhej sa pridajú latexové častice; zmes sa inkubuje pri 37 °C počas 25 minút. Výsledky sa odčítajú pri 540 nm na čítačke a vyjadria sa v ľubovoľných jednotkách. Vypočíta sa stimulačný koeficient (K _st ), ktorý sa rovná pomeru optickej hustoty vo stimulovaných jamkách k priemernej optickej hustote v jamkách bez stimulácie. U zdravých ľudí je NBT _spont = 90 ± 45 CU, NBT _stim = 140 ± 60 CU. K _st = 1,78 ± 0,36.
• Štúdia adhéznych molekúl. Prietoková cytofluorometria sa používa na stanovenie expresie povrchových antigénov CD11a/CD18, CD11b/CD18, CD11c/CD18. Imunodeficiencie so zhoršenou adhéziou sa prejavujú opakovanými infekciami, pomalým hojením rán a absenciou hnisu v ložiskách infekcie.

Štúdium komplementového systému

Skríningové metódy

Stanovenie hemolytickej aktivity komplementu je štúdium klasickej dráhy aktivácie komplementu. Rôzne riedenia séra od chorého a zdravého človeka sa pridávajú k erytrocytom barana potiahnutým protilátkami. Jednotkou hemolytickej aktivity je prevrátená hodnota riedenia séra, pri ktorom je zničených 50 % erytrocytov. Stupeň hemolýzy sa odhaduje fotometricky uvoľnením hemoglobínu do roztoku. Pokles hemolytickej aktivity komplementu sa pozoruje pri systémovom lupus erythematosus s poškodením obličiek, akútnej glomerulonefritíde, kombinovaných imunodeficienciách, myasténii, vírusovej hepatitíde, lymfómoch, zvýšenie - pri obštrukčnej žltačke, Hashimotovej tyreoiditíde, reumatizme, reumatoidnej artritíde, nodulárnej periarteritíde, dermatomyozitíde, infarkte myokardu, ulceróznej kolitíde, Reiterovom syndróme, dne.

Metódy objasňovania

• Stanovenie zložiek komplementu. Kvantitatívne stanovenie sa vykonáva radiálnou imunodifúziou a nefelometriou.
  Štúdia nie je informatívna, pokiaľ sa nezmenia antigénne vlastnosti zložiek komplementu.
• Bolo zistené, že zložka komplementu Clq zvyšuje fagocytózu a sprostredkováva bunkovú cytotoxicitu. K jej poklesu dochádza pri ochoreniach imunitných komplexov, systémovom lupus erythematosus, hnisavých infekciách a nádoroch.
• Zložka C3 sa podieľa na aktivácii klasických a alternatívnych dráh komplementu. Pokles jej koncentrácie je spojený s chronickými bakteriálnymi a plesňovými infekciami, prítomnosťou cirkulujúcich alebo tkanivových imunitných komplexov.
• Zložka C4 sa podieľa na aktivácii klasickej dráhy. Pokles jej koncentrácie je spojený s predĺženou aktiváciou komplementu imunitnými komplexmi a so znížením koncentrácie inhibítora C1, ktorý riadi aktiváciu klasickej dráhy komplementu. Nedostatok C4 sa vyskytuje pri systémovom lupus erythematosus, zvýšenie C4 sa vyskytuje pri ochorení obličiek, odmietnutí transplantátu, akútnom zápale a gastrointestinálnych ochoreniach.
• C5a je malý fragment molekuly C5, ktorý sa od nej odštiepi v dôsledku aktivácie komplementového systému. Jeho koncentrácia sa zvyšuje počas zápalu, sepsy, atopických a alergických ochorení.
• Cl-inhibítor je multifunkčný faktor. Riadi aktiváciu zložky komplementu C1, inhibuje aktivitu kalikreínu, plazmínu a aktivovaného Hagemanovho faktora, Cl5 a Or proteáz. Nedostatok C1-inhibítora vedie k angioedému.
• funkčné štúdie komplementu. Testované sérum sa pridá k štandardnému séru, ktorému chýba akákoľvek zložka komplementu, a stanoví sa hemolytická aktivita komplementu. Ak sa hemolytická aktivita neobnoví na normálnu hodnotu, aktivita tejto zložky komplementu v testovanom sére sa považuje za zníženú.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]