Komáre so zabudovaným „genetickým štítom“ zastavujú maláriu – miera infekcie klesá o 93 %

Prekonanie rezistencie na insekticídy: Ako sa jediná génová modifikácia u komárov samovoľne šíri naprieč generáciami, čím prakticky eliminuje prenos malárie bez ohrozenia prežitia.

V nedávno publikovanej štúdii v časopise Nature tím vedcov skúmal, či alela glutamínu 224 (Q224) v proteíne FREP1 (fibrinogén-príbuznom proteíne 1) robí komáre Anopheles stephensi odolnými voči infekcii Plasmodium, odhadol náklady na prežitie spojené s touto alelou a testoval systém alelického génového pohonu na šírenie tejto ochrannej mutácie v populáciách.

Predpoklady

V roku 2023 zomrelo na maláriu približne 600 000 ľudí, väčšinou detí v subsaharskej Afrike a južnej Ázii. Tradičné metódy kontroly – siete proti komárom, insekticídy, antimalariká – strácajú svoju účinnosť kvôli rezistencii komárov a parazitov. Technológie génového pohonu, ktoré šíria prospešné alely prostredníctvom populácií komárov, ponúkajú sľubné a udržateľné riešenie.

Proteín FREP1 pomáha parazitom preniknúť cez stredné črevo komára, ale prirodzený variant Q224 dokáže zabrániť infekcii bez toho, aby to ohrozilo biológiu komára. Cieľom bolo otestovať, či by sa takáto endogénna alela dala bezpečne distribuovať, aby sa znížil prenos malárie a zároveň sa zachovala životaschopnosť komára.

O štúdii

Pomocou CRISPR/Cas9 boli vytvorené dva kmene Anopheles stephensi, ktoré sa líšili iba 224. aminokyselinou v proteíne FREP1: divoký typ s leucínom (L224) a potenciálne ochranný kmeň s glutamínom (Q224). Vodiaca RNA cielila intrónovú oblasť 126 bp pred kodónom, čo umožnilo homológnu rekombináciu s vložením fluorescenčnej značky (GFP alebo RFP).

Kondícia sa hodnotila podľa dĺžky krídel, plodnosti, liahnivosti vajec, kuklivosti, vyliahnutia dospelých jedincov a dĺžky života (Kaplan-Meierova analýza prežitia).

Kompetencia vektora bola stanovená pomocou štandardného membránového kŕmenia parazitov Plasmodium falciparum (človek) a Plasmodium berghei (hlodavec) s počtom oocýst a sporozoitov v slinných žľazách.

Systém riadenia alel zahŕňal kazetu s gRNA proti L224 a Cas9 pod kontrolou promótora vasa. Frekvencie alel boli monitorované pomocou fluorescenčných značiek v multicyklových experimentoch (10 generácií). Genotypizácia bola vykonaná pomocou PCR, Sangerovho sekvenovania a NGS. Bayesovské modelovanie odhadlo konverziu alel, náklady na fitness a dynamiku počas voľného párenia v laboratóriu.

Výsledky

Alela FREP1Q224 nespôsobila významné straty v prežití: dĺžka krídel, plodnosť, liahnutie, kukla a vyliahnutie dospelých jedincov boli identické s kontrolnou skupinou FREP1L224. Malé rozdiely vo veľkosti a dĺžke života samcov neovplyvnili konkurencieschopnosť. Panenské samice FREP1Q224 žili rovnako dlho ako kontrolné skupiny a samice po kŕmení krvou vykazovali len mierne skrátenie dĺžky života.

Výzva na experimenty odhalila výraznú ochranu u homozygotov.

• Pri nízkych koncentráciách gametocytov P. falciparum (0,08 %):
  • Miera infekcie klesla v štúdii FREP1Q224 z 80 % na ~30 %;
  • Priemerný počet oocýst: od 3 do 0;
  • Sporozoity v slinných žľazách: od >4000 do 0.
• Pri vyššej gametocytémii (0,15 %):
  • Priemerný počet oocýst: od ~32 do
  • Sporozoity tiež dramaticky klesli.
• Pre P. berghei:
  • Priemerný počet oocýst: od 43 do 25;
  • Sporozoity: od ~19 000 do 11 000.
• Heterozygoti (FREP1L224/Q224) neboli chránení.

Účinnosť génového pohonu

• V párových kríženiach Cas9 + gRNA L224 konvertovala 50 až 86 % alel FREP1L224 na FREP1Q224;
• Pri materskom Cas9 bola frekvencia vyššia;
• V 2. generácii dosiahla frekvencia ochrannej alely 93 %;
• Výskyt chýb v opravnej dráhe NHEJ bol nízky (0–12 %) a typicky spôsoboval poškodenie.
• V bunkových populáciách s pomerom darca:príjemca 1:3 sa frekvencia FREP1Q224 zvýšila z 25 % na > 90 % počas 10 generácií;
• Frekvencia alel NHEJ klesla z 5,4 % na

Bayesovské modelovanie podporilo hypotézu vysokej konverzie, nízkej frekvencie stabilných mutácií a efektu letálneho sterilného mozaiky, kde WT homozygoti s materským genotypom Cas9 trpeli somatickými mutáciami a znížili prežitie.

Neskoršie generácie preukázali takmer úplné potlačenie oocýst P. falciparum (medián 0 až 5,5), čo potvrdzuje, že populácia sa stala do značnej miery odolnou voči prenosu parazitov.

Ochranná alela nemala žiadne skryté výhody ani vedľajšie účinky a šírila sa pudom.

Závery

Štúdia zistila, že nahradenie jednej aminokyseliny v proteíne FREP1 a zmena jeho dedičnosti pomocou génového mechanizmu by mohlo urobiť Anopheles stephensi prakticky imúnnym voči malárii – ľudskej aj hlodavčej – bez toho, aby bola ohrozená životaschopnosť komárov.

Tento prístup dopĺňa existujúce opatrenia (siete, insekticídy, lieky), ktorých účinnosť je znížená rezistenciou. Takýto systém možno použiť aj na obnovenie citlivosti na insekticídy alebo na zavedenie iných ochranných alel.

Pred implementáciou technológie sú potrebné prísne environmentálne, etické a riadiace rámce, ako aj systémy na kontrolu šírenia.