Umelé srdcové chlopne

Moderné biologické umelé srdcové chlopne dostupné na klinické použitie, s výnimkou pľúcneho autograftu, sú neživotaschopné štruktúry, ktoré nemajú potenciál rastu a reparácie tkaniva. To značne obmedzuje ich použitie, najmä u detí, na korekciu chlopňovej patológie. Tkanivové inžinierstvo sa vyvinulo za posledných 15 rokov. Cieľom tohto vedeckého smeru je vytvoriť v umelých podmienkach také štruktúry, ako sú umelé srdcové chlopne s tromborezistentným povrchom a životaschopným intersticiom.

[ 1 ], [ 2 ]

Ako sa vyvíjajú umelé srdcové chlopne?

Vedecký koncept tkanivového inžinierstva je založený na myšlienke osídľovania a pestovania živých buniek (fibroblastov, kmeňových buniek atď.) v syntetickom alebo prirodzenom absorbovateľnom lešení (matrici), čo je trojrozmerná ventilová štruktúra, ako aj na využití signálov, ktoré regulujú génovú expresiu, organizáciu a produktivitu transplantovaných buniek počas obdobia tvorby extracelulárnej matrice.

Takéto umelé srdcové chlopne sa integrujú s tkanivom pacienta pre konečnú obnovu a ďalšie udržanie ich štruktúry a funkcie. V tomto prípade sa na pôvodnej matrici vytvorí nová kolagénovo-elastínová štruktúra alebo presnejšie extracelulárna matrica v dôsledku fungovania buniek (fibroblastov, myofibroblastov atď.). V dôsledku toho by optimálne umelé srdcové chlopne vytvorené tkanivovým inžinierstvom mali byť blízke pôvodným chlopniam z hľadiska anatomickej štruktúry a funkcie a mali by mať aj biomechanickú adaptabilitu, schopnosť reparácie a rastu.

Tkanivové inžinierstvo vyvíja umelé srdcové chlopne s použitím rôznych zdrojov bunkového zberu. Môžu sa teda použiť xenogénne alebo alogénne bunky, hoci tie prvé sú spojené s rizikom prenosu zoonóz na ľudí. Genetickou modifikáciou alogénnych buniek je možné znížiť antigenicitu a zabrániť odmietavým reakciám tela. Tkanivové inžinierstvo vyžaduje spoľahlivý zdroj buniek. Takýmto zdrojom sú autogénne bunky odobraté priamo od pacienta a počas reimplantácie nevyvolávajú imunitné reakcie. Účinné umelé srdcové chlopne sa vyrábajú na základe autológnych buniek získaných z krvných ciev (tepní a žíl). Na získanie čistých bunkových kultúr bola vyvinutá metóda založená na použití fluorescenčne aktivovaného triedenia buniek - FACS. Zmiešaná bunková populácia získaná z krvnej cievy je označená acetylovaným lipoproteínovým markerom s nízkou hustotou, ktorý sa selektívne absorbuje na povrchu endotelocytov. Endotelové bunky sa potom dajú ľahko oddeliť od väčšiny buniek získaných z ciev, ktoré budú zmesou buniek hladkého svalstva, myofibroblastov a fibroblastov. Zdroj buniek, či už tepna alebo žila, ovplyvní vlastnosti výsledného konštruktu. Umelé srdcové chlopne s matricou naočkovanou venóznymi bunkami sú teda lepšie v tvorbe kolagénu a mechanickej stabilite ako konštrukty naočkované arteriálnymi bunkami. Voľba periférnych žíl sa javí ako pohodlnejší zdroj zberu buniek.

Myofibroblasty sa dajú odobrať aj z krčných tepien. Bunky pochádzajúce z ciev sa však výrazne líšia od prirodzených intersticiálnych buniek. Ako alternatívny zdroj buniek možno použiť autológne bunky pupočníkovej šnúry.

Umelé srdcové chlopne na báze kmeňových buniek

V posledných rokoch bol pokrok v tkanivovom inžinierstve uľahčený výskumom kmeňových buniek. Použitie kmeňových buniek červenej kostnej drene má svoje výhody. Najmä jednoduchosť zberu biomateriálu a kultivácie in vitro s následnou diferenciáciou na rôzne typy mezenchymálnych buniek umožňuje vyhnúť sa použitiu intaktných ciev. Kmeňové bunky sú pluripotentnými zdrojmi bunkových línií a majú jedinečné imunologické vlastnosti, ktoré prispievajú k ich stabilite v alogénnych podmienkach.

Kmeňové bunky ľudskej červenej kostnej drene sa získavajú sternálnou punkciou alebo punkciou bedrového hrebeňa. Izolujú sa z 10 – 15 ml aspirátu sterna, oddelia sa od ostatných buniek a kultivujú sa. Po dosiahnutí požadovaného počtu buniek (zvyčajne do 21 – 28 dní) sa vysejú (kolonizujú) na matrice a kultivujú sa v živnom médiu v statickej polohe (7 dní vo zvlhčenom inkubátore pri teplote 37 °C v prítomnosti 5 % CO2). Následne sa rast buniek stimuluje kupturálnym médiom (biologické podnety) alebo vytvorením fyziologických podmienok pre rast tkaniva počas jeho izometrickej deformácie v reprodukčnom zariadení s pulzujúcim prúdením – bioreaktore (mechanické podnety). Fibroblasty sú citlivé na mechanické podnety, ktoré podporujú ich rast a funkčnú aktivitu. Pulzujúci prúd spôsobuje zvýšenie radiálnych aj obvodových deformácií, čo vedie k orientácii (predĺženiu) osídlených buniek v smere týchto napätí. To následne vedie k tvorbe orientovaných vláknitých štruktúr chlopní. Konštantný prúd spôsobuje na stenách iba tangenciálne napätia. Pulzujúci tok má priaznivý vplyv na bunkovú morfológiu, proliferáciu a zloženie extracelulárnej matrice. Povaha toku živného média, fyzikálno-chemické podmienky (pH, pO2 a pCO2) v bioreaktore tiež významne ovplyvňujú produkciu kolagénu. Laminárny tok a cyklické vírivé prúdy teda zvyšujú produkciu kolagénu, čo vedie k zlepšeniu mechanických vlastností.

Ďalším prístupom k pestovaniu tkanivových štruktúr je vytvorenie embryonálnych podmienok v bioreaktore namiesto simulácie fyziologických podmienok ľudského tela. Tkanivové biochlopne pestované na báze kmeňových buniek majú mobilné a flexibilné chlopne, funkčne schopné pod vplyvom vysokého tlaku a prietoku presahujúceho fyziologickú úroveň. Histologické a histochemické štúdie chlopní týchto štruktúr preukázali prítomnosť aktívnych procesov biodeštrukcie matrice a jej nahradenia životaschopným tkanivom. Tkanivo je organizované podľa vrstevnatého typu s charakteristikami extracelulárnych proteínov matrice podobnými vlastnostiam natívneho tkaniva, prítomnosťou kolagénu typu I a III a glykozaminoglykánov. Typická trojvrstvová štruktúra chlopní - ventrikulárna, špongiózna a vláknitá vrstva - však nebola dosiahnutá. ASMA-pozitívne bunky exprimujúce vimentín nájdené vo všetkých fragmentoch mali charakteristiky podobné vlastnostiam myofibroblastov. Elektrónová mikroskopia odhalila bunkové prvky so znakmi charakteristickými pre životaschopné, sekrečne aktívne myofibroblasty (aktínové/myozínové filamenty, kolagénové vlákna, elastín) a endotelové bunky na povrchu tkaniva.

Na cípoch bol detegovaný kolagén typu I, III, ASMA a vimentín. Mechanické vlastnosti cípov tkaniva a natívnych štruktúr boli porovnateľné. Tkanivové umelé srdcové chlopne vykazovali vynikajúci výkon počas 20 týždňov a svojou mikroštruktúrou, biochemickým profilom a tvorbou proteínovej matrice sa podobali prirodzeným anatomickým štruktúram.

Všetky umelé srdcové chlopne získané tkanivovým inžinierstvom boli implantované zvieratám v pulmonálnej polohe, pretože ich mechanické vlastnosti nezodpovedajú zaťaženiu v aortálnej polohe. Tkanivové chlopne extrahované zo zvierat majú štruktúru blízku pôvodným, čo naznačuje ich ďalší vývoj a reštrukturalizáciu in vivo. Či proces reštrukturalizácie a dozrievania tkaniva bude pokračovať za fyziologických podmienok po implantácii umelých srdcových chlopní, ako sa pozorovalo v experimentoch na zvieratách, ukážu ďalšie štúdie.

Ideálne umelé srdcové chlopne by mali mať pórovitosť najmenej 90 %, pretože je to nevyhnutné pre rast buniek, dodávanie živín a odstraňovanie produktov bunkového metabolizmu. Okrem biokompatibility a biodegradovateľnosti by mali mať umelé srdcové chlopne chemicky priaznivý povrch pre očkovanie buniek a mali by zodpovedať mechanickým vlastnostiam prirodzeného tkaniva. Úroveň biodegradácie matrice by mala byť kontrolovateľná a úmerná úrovni tvorby nového tkaniva, aby sa zabezpečila mechanická stabilita v priebehu času.

V súčasnosti sa vyvíjajú syntetické a biologické matrice. Najbežnejšími biologickými materiálmi na vytváranie matríc sú darcovské anatomické štruktúry, kolagén a fibrín. Polymérne umelé srdcové chlopne sa navrhujú tak, aby sa po implantácii biodegradovali, hneď ako implantované bunky začnú produkovať a organizovať si vlastnú sieť extracelulárnej matrice. Tvorbu nového tkaniva matrice možno regulovať alebo stimulovať rastovými faktormi, cytokínmi alebo hormónmi.

[ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Umelé srdcové chlopne darcov

Ako matrice sa môžu použiť umelé srdcové chlopne od darcov získané od ľudí alebo zvierat a zbavené bunkových antigénov decellularizáciou za účelom zníženia ich imunogenicity. Konzervované proteíny extracelulárnej matrice sú základom pre následnú adhéziu nasadených buniek. Existujú nasledujúce metódy odstraňovania bunkových prvkov (acellularizácia): zmrazenie, ošetrenie trypsínom/EDTA, detergenty - dodecylsulfát sodný, deoxykolát sodný, Triton X-100, MEGA 10, TnBR CHAPS, Tween 20, ako aj viacstupňové enzymatické metódy ošetrenia. V tomto prípade sa odstraňujú bunkové membrány, nukleové kyseliny, lipidy, cytoplazmatické štruktúry a rozpustné molekuly matrice, pričom sa zachová kolagén a elastín. Ideálna metóda však zatiaľ nebola nájdená. Iba dodecylsulfát sodný (0,03-1 %) alebo deoxykolát sodný (0,5-2 %) viedli k úplnému odstráneniu buniek po 24 hodinách ošetrenia.

Histologické vyšetrenie odstránených decelularizovaných biovýchlopní (alograft a xenograft) v experimente na zvieratách (pes a ošípané) preukázalo čiastočnú endotelizáciu a vrastanie myofibroblastov príjemcu do bázy bez známok kalcifikácie. Bola zaznamenaná mierna zápalová infiltrácia. Počas klinických skúšok decelularizovanej chlopne SynerGraft™ sa však vyvinulo skoré zlyhanie. V matrici bioprotézy sa zistila výrazná zápalová reakcia, ktorá bola spočiatku nešpecifická a sprevádzaná lymfocytovou reakciou. V priebehu jedného roka sa vyvinula dysfunkcia a degenerácia bioprotézy. Nebola zaznamenaná žiadna bunková kolonizácia matrixu, ale bola zistená kalcifikácia chlopní a zvyšky preimplantačných buniek.

Bezbunkové matrice naočkované endotelovými bunkami a kultivované in vitro a in vivo vytvorili na povrchu chlopní koherentnú vrstvu a naočkované intersticiálne bunky natívnej štruktúry preukázali svoju schopnosť diferenciácie. Za dynamických podmienok bioreaktora však nebolo možné dosiahnuť požadovanú fyziologickú úroveň kolonizácie buniek na matrici a implantované umelé srdcové chlopne boli sprevádzané pomerne rýchlym (trojmesačným) zhrubnutím v dôsledku zrýchlenej proliferácie buniek a tvorby extracelulárnej matrice. V tejto fáze má teda použitie bezbunkových matríc darcov na ich kolonizáciu bunkami množstvo nevyriešených problémov vrátane imunologických a infekčných; práca na decelularizovaných bioprotézach pokračuje.

Treba poznamenať, že kolagén je tiež jedným z potenciálnych biologických materiálov na výrobu matríc schopných biodegradácie. Môže sa použiť vo forme peny, gélu alebo platní, špongií a ako polotovar na báze vlákien. Použitie kolagénu je však spojené s množstvom technologických ťažkostí. Najmä je ťažké ho získať od pacienta. Preto je v súčasnosti väčšina kolagénových matríc živočíšneho pôvodu. Pomalá biodegradácia živočíšneho kolagénu môže niesť zvýšené riziko infekcie zoonózami, spôsobiť imunologické a zápalové reakcie.

Fibrín je ďalší biologický materiál s kontrolovanými biodegradačnými vlastnosťami. Keďže fibrínové gély sa dajú vyrobiť z krvi pacienta na následnú výrobu autológnej matrice, implantácia takejto štruktúry nespôsobí jej toxickú degradáciu a zápalovú reakciu. Fibrín má však nevýhody, ako je difúzia a vyplavovanie do prostredia a nízke mechanické vlastnosti.

[ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Umelé srdcové chlopne vyrobené zo syntetických materiálov

Umelé srdcové chlopne sa tiež vyrábajú zo syntetických materiálov. Niekoľko pokusov o výrobu matríc chlopní bolo založených na použití polyglaktínu, kyseliny polyglykolovej (PGA), kyseliny polymliečnej (PLA), kopolyméru PGA a PLA (PLGA) a polyhydroxyalkanoátov (PHA). Vysoko porézny syntetický materiál je možné získať z opletených alebo neopletených vlákien a pomocou technológie lúhovania soľami. Sľubný kompozitný materiál (PGA/P4HB) na výrobu matríc sa získava z neopletených slučiek kyseliny polyglykolovej (PGA) potiahnutých poly-4-hydroxybutyrátom (P4HB). Umelé srdcové chlopne vyrobené z tohto materiálu sa sterilizujú etylénoxidom. Významná počiatočná tuhosť a hrúbka slučiek týchto polymérov, ich rýchla a nekontrolovaná degradácia, sprevádzaná uvoľňovaním kyslých cytotoxických produktov, si však vyžadujú ďalší výskum a hľadanie iných materiálov.

Použitie autológnych platní na kultiváciu tkaniva myofibroblastov kultivovaných na lešení za účelom vytvorenia podporných matríc stimuláciou produkcie týchto buniek umožnilo získať vzorky chlopní s aktívnymi životaschopnými bunkami obklopenými extracelulárnou matricou. Mechanické vlastnosti tkanív týchto chlopní sú však stále nedostatočné na ich implantáciu.

Požadovaná úroveň proliferácie a regenerácie tkaniva vytváranej chlopne sa nemusí dosiahnuť iba kombináciou buniek a matrice. Expresia bunkových génov a tvorba tkaniva sa môžu regulovať alebo stimulovať pridaním rastových faktorov, cytokínov alebo hormónov, mitogénnych faktorov alebo adhéznych faktorov do matríc a lešení. Možnosť zavedenia týchto regulátorov do matricových biomateriálov sa skúma. Celkovo existuje značný nedostatok výskumu zameraného na reguláciu tvorby tkanivových chlopní biochemickými stimulmi.

Acelulárna bravčová xenogénna pľúcna bioprotéza Matrix P pozostáva z decelularizovaného tkaniva spracovaného špeciálnym patentovaným postupom spoločnosti AutoTissue GmbH, vrátane ošetrenia antibiotikami, deoxycholátom sodným a alkoholom. Táto metóda spracovania, schválená Medzinárodnou organizáciou pre normalizáciu, eliminuje všetky živé bunky a postcelulárne štruktúry (fibroblasty, endotelové bunky, baktérie, vírusy, huby, mykoplazmy), zachováva architektúru extracelulárnej matrice, minimalizuje hladinu DNA a RNA v tkanivách, čo znižuje na nulu pravdepodobnosť prenosu bravčového endogénneho retrovírusu (PERV) na človeka. Bioprotéza Matrix P pozostáva výlučne z kolagénu a elastínu so zachovanou štrukturálnou integráciou.

V experimentoch na ovciach bola 11 mesiacov po implantácii bioprotézy Matrix P zaznamenaná minimálna reakcia okolitých tkanív s dobrou mierou prežitia, čo bolo obzvlášť zrejmé na lesklom vnútornom povrchu jej endokardu. Zápalové reakcie, zhrubnutie a skrátenie chlopňových chlopní boli prakticky neprítomné. V bioprotéze Matrix P boli tiež zaznamenané nízke hladiny vápnika v tkanivách, pričom rozdiel bol štatisticky významný v porovnaní s tými, ktoré boli liečené glutaraldehydom.

Umelá srdcová chlopňa Matrix P sa prispôsobí individuálnym podmienkam pacienta v priebehu niekoľkých mesiacov po implantácii. Vyšetrenie na konci kontrolného obdobia odhalilo intaktnú extracelulárnu matricu a konfluentný endotel. Xenograft Matrix R implantovaný 50 pacientom s vrodenými chybami počas Rossovho zákroku v rokoch 2002 až 2004 preukázal vynikajúci výkon a nižšie transvalvulárne tlakové gradienty v porovnaní s kryokonzervovanými a decelularizovanými alotransplantátmi SynerGraftMT a glutaraldehydom ošetrenými bioprotézami bez scaffoldu. Umelé srdcové chlopne Matrix P sú určené na náhradu pľúcnej chlopne počas rekonštrukcie výtokového traktu pravej komory pri chirurgických zákrokoch pre vrodené a získané chyby a počas náhrady pľúcnej chlopne počas Rossovho zákroku. Sú dostupné v 4 veľkostiach (podľa vnútorného priemeru): pre novorodencov (15-17 mm), pre deti (18-21 mm), stredne veľké (22-24 mm) a dospelých (25-28 mm).

Pokrok vo vývoji tkanivovo inžinierskych chlopní bude závisieť od pokroku v biológii buniek chlopní (vrátane otázok génovej expresie a regulácie), štúdií embryogénneho a s vekom súvisiaceho vývoja chlopní (vrátane angiogénnych a neurogénnych faktorov), presných znalostí biomechaniky každej chlopne, identifikácie vhodných buniek na očkovanie a vývoja optimálnych matríc. Ďalší vývoj pokročilejších tkanivových chlopní si bude vyžadovať dôkladné pochopenie vzťahu medzi mechanickými a štrukturálnymi vlastnosťami natívnych chlopní a stimulmi (biologickými a mechanickými) na obnovenie týchto charakteristík in vitro.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]