Úloha kryštálových usadenín v patogenéze osteoartrózy

Kryštály zásaditého fosforečnanu vápenatého (BCP) sa nachádzajú v synoviálnej tekutine u 30 – 60 % pacientov s osteoartrózou. Podľa A. Swana a kol. (1994) sa kryštály obsahujúce vápnik nachádzajú v synoviálnej tekutine u oveľa väčšieho počtu pacientov s osteoartrózou; avšak kvôli extrémne malej veľkosti kryštálov alebo ich malému počtu nie sú identifikované pomocou konvenčných techník. Prítomnosť kryštálov BCP v synoviálnej tekutine koreluje s rádiografickými príznakmi degenerácie kĺbovej chrupavky a je spojená s väčším objemom výpotku v porovnaní s výpotkom v kolenných kĺboch bez kryštálov. Štúdia faktorov ovplyvňujúcich rádiografickú progresiu gonartrózy ukázala, že ukladanie kryštálov dihydrátu pyrofosforečnanu vápenatého (CPPD) je prediktorom nepriaznivého klinického a rádiografického výsledku. V štúdii starších pacientov sa zistilo, že osteoartróza je spojená s chondrokalcinózou, najmä v laterálnom tibiofemorálnom kompartmente kolena a prvých troch metakarpofalangeálnych kĺboch. Nie je nezvyčajné, že u pacientov s osteoartrózou sa nachádzajú oba typy kryštálov, OFC aj PFC.

Klinicky sa degenerácia kĺbovej chrupavky spôsobená ukladaním kryštálov vápnika líši od degenerácie pozorovanej pri primárnej osteoartróze. Ak by kryštály boli jednoduchým epifenoménom degenerácie chrupavky, nachádzali by sa v kĺboch najčastejšie postihnutých primárnou osteoartrózou, t. j. v kolenách, bedrách a malých kĺboch rúk. Naproti tomu ochorenia spojené s ukladaním kryštálov najčastejšie postihujú kĺby, ktoré nie sú typické pre primárnu osteoartrózu, ako je rameno, zápästie a lakeť. Prítomnosť kryštálov v kĺbovej (výpotkovej) tekutine je spojená so závažnejšou degeneráciou kĺbovej chrupavky. Diskutuje sa o otázke, čo je príčinou a čo dôsledkom, ukladanie kryštálov alebo degenerácia chrupavky. Medziľahlú pozíciu zaujíma nasledujúci predpoklad: primárna anomália v metabolizme chrupavky vedie k jej degenerácii a sekundárne ukladanie kryštálov urýchľuje jej degradáciu (tzv. teória amplifikačnej slučky).

Presný mechanizmus, ktorým kryštály vápnika poškodzujú kĺbovú chrupavku, nie je známy a je zhrnutý nižšie. Teoreticky môžu kryštály vápnika priamo poškodiť chondrocyty. Histologické vyšetrenie však zriedkavo odhalí kryštály v blízkosti chondrocytov a ešte zriedkavejšie sú nimi požité. Najpravdepodobnejším mechanizmom je fagocytóza kryštálov bunkami synoviálnej výstelky, po ktorej nasleduje uvoľňovanie proteolytických enzýmov alebo sekrécia cytokínov, ktoré stimulujú uvoľňovanie enzýmov z chondrocytov. Túto koncepciu podporuje štúdia úlohy synovitídy indukovanej PFKD pri rozvoji rýchlo progresívnej osteoartrózy pri pyrofosfátovej artropatii. V tejto štúdii boli kryštály dihydrátu pyrofosfátu vápenatého (1 alebo 10 mg) injekčne podávané týždenne do pravého kolena králikov s osteoartrózou vyvolanou čiastočnou laterálnou meniscektomiou. Ukázalo sa, že po 8 injekciách vykazoval pravý kolenný kĺb výrazne závažnejšie zmeny v porovnaní s ľavým. Intenzita synoviálneho zápalu korelovala s intraartikulárnymi injekciami kryštálov dihydrátu pyrofosfátu vápenatého a ich dávkou. Napriek tomu, že dávky kryštálov CPPD použité v tejto štúdii prevyšujú dávky in vivo, výsledky naznačujú úlohu zápalu indukovaného CPPD v progresii osteoartritídy pri pyrofosfátovej artropatii.

Potenciálne mechanizmy indukcie poškodenia kĺbovej chrupavky kryštálmi obsahujúcimi vápnik sú spojené s ich mitogénnymi vlastnosťami, schopnosťou indukovať MMP a stimulovať syntézu prostaglandínov.

Mitogénny účinok kryštálov obsahujúcich vápnik. Pri artropatiách spojených s kryštálmi sa často pozoruje proliferácia buniek synoviálnej výstelky, pričom samotné kryštály sú za tento proces zodpovedné len čiastočne. Zvýšenie počtu synoviálnych buniek je sprevádzané zvýšenou sekréciou cytokínov, ktoré podporujú chondrolýzu a indukujú sekréciu proteolytických enzýmov. Kryštály OFC v koncentráciách nachádzajúcich sa v patológii ľudských kĺbov stimulujú v závislosti od dávky mitogenézu pokojových kultúr kožných fibroblastov a synoviálnych fibroblastov psov a myší. Kryštály dihydrátu pyrofosforečnanu vápenatého, urátu, síranu, uhličitanu a fosforečnanu vápenatého stimulujú rast buniek. Nástup a vrchol inkorporácie ( ^3H )-tymidínu indukovanej týmito kryštálmi sú posunuté o 3 hodiny v porovnaní so stimuláciou buniek krvným sérom. Toto časové obdobie môže byť potrebné na fagocytózu a rozpustenie kryštálov. Pridanie kontrolných kryštálov rovnakej veľkosti (napr. diamantový prach alebo latexové častice) nestimulovalo mitogenézu. Kryštály monohydrátu urátu sodného mali slabé mitogénne vlastnosti a boli výrazne horšie ako kryštály urátu vápenatého, čo naznačuje dôležitosť obsahu vápnika v kryštáloch v mitogenéze. Syntetické kryštály OFC mali rovnaké mitogénne vlastnosti ako kryštály získané od pacientov s chondrokalcinózou. Mitogénny účinok kryštálov obsahujúcich vápnik nebol výsledkom zvýšenia obsahu vápnika v okolitom živnom médiu in vitro, pretože rozpustenie zásaditých kryštálov fosforečnanu vápenatého v živnom médiu nestimulovalo inkorporáciu ( ^3H )-tymidínu fibroblastmi.

Jeden z navrhovaných mechanizmov mitogenézy indukovanej OFC spočíva v tom, že abnormálna proliferácia synoviálnych buniek môže byť aspoň čiastočne spôsobená endocytózou a intracelulárnym rozpúšťaním kryštálov, čo zvyšuje cytoplazmatické koncentrácie Ca2 ⁺ a aktivuje dráhu závislú od vápnika vedúcu k mitogenéze. Túto koncepciu podporuje požiadavka priameho kontaktu bunka-kryštál na stimuláciu mitogenézy, pretože vystavenie bunkových kultúr kryštálom indukovalo rast buniek, zatiaľ čo vystavenie buniek zbavených takéhoto kontaktu nie. Na štúdium požiadavky na fagocytózu kryštálov po interakcii bunka-kryštál boli bunky kultivované s ^45Ca -OPC a ( ^3H )-tymidínom. Zistilo sa, že bunky obsahujúce ^45Ca -OPC inkorporovali významne viac ( ^3H )-tymidínu ako bunky bez značenia bázickým fosforečnanom vápenatým. V makrofágových kultúrach viedla inhibícia endocytózy kryštálov cytochalazínom k inhibícii rozpúšťania kryštálov, čo ďalej zdôrazňuje nevyhnutnosť fagocytózy.

Kryštály obsahujúce vápnik sú rozpustné v kyseline. Po fagocytóze sa kryštály rozpúšťajú v kyslom prostredí makrofágových fagolyzozómov. Chlorochín, chlorid amónny, bafilomycín A1 a všetky lyzozomotropné látky, ktoré zvyšujú pH lyzozómov, inhibujú v závislosti od dávky intracelulárne rozpúšťanie kryštálov a absorpciu (3H)-tymidínu ^vo fibroblastoch kultivovaných s kryštálmi zásaditého fosforečnanu vápenatého.

Pridanie kryštálov OFC do monovrstvovej kultúry fibroblastov spôsobilo okamžitý desaťnásobný nárast intracelulárneho vápnika, ktorý sa po 8 minútach vrátil na východiskovú hodnotu. Zdrojom vápnika boli prevažne extracelulárne ióny, pretože zásadité kryštály fosforečnanu vápenatého boli pridané do kultivačného média bez vápnika. Ďalšie zvýšenie intracelulárnej koncentrácie vápnika bolo pozorované po 60 minútach a trvalo najmenej 3 hodiny. V tomto prípade boli zdrojom vápnika fagocytované kryštály rozpustené vo fagolyzozómoch.

Zistilo sa, že mitogénny účinok kryštálov OFC je podobný účinku PDGF ako rastového faktora; podobne ako PDGF, aj kryštály OFC vykazujú synergický účinok s IGF-1 a krvnou plazmou. Blokáda IGF-1 znižuje mitogenézu buniek v reakcii na OFC. PG Mitchell a kol. (1989) ukázali, že indukcia mitogenézy vo fibroblastoch Balb/c- _{3 T3 kryštálmiOFC} vyžaduje prítomnosť serín/treonínovej proteínkinázy C (PKC), jedného z hlavných mediátorov signálov generovaných počas vonkajšej stimulácie buniek hormónmi, neurotransmitermi a rastovými faktormi. Zníženie aktivity PKC v bunkách Balb/c-3 T3 _{inhibuje indukciu protoonkogénov c-fos a c-myc sprostredkovanúOFC}, ale neovplyvňuje stimuláciu týchto onkogénov sprostredkovanú PDGF.

Zvýšenie intracelulárneho vápnika po rozpustení fagocytovaných kryštálov nie je jedinou signálnou dráhou mitogenézy. Keď sa rastové faktory, ako je PDGF, viažu na svoj membránový receptor, stimuluje sa fosfolipáza C (fosfodiesteráza), ktorá hydrolyzuje fosfatidylinositol-4,5-bisfosfát za vzniku intracelulárnych poslov inozitol-3-fosfátu a diacylglycerolu. Prvý z nich uvoľňuje vápnik z endoplazmatického retikula moduláciou aktivity enzýmov závislých od vápnika a od vápnika/kalmodulínu, ako sú proteínkinázy a proteázy.

R. Rothenberg a H. Cheung (1988) zaznamenali zvýšenú degradáciu fosfatidylinositol-4,5-bisfosfátu fosfolipázou C v synoviálnych bunkách králika v reakcii na stimuláciu kryštálmi OFC. Tieto kryštály významne zvýšili obsah inozitol-1-fosfátu v bunkách so značeným ( ^3H )-inozitolom; vrchol sa dosiahol do 1 minúty a pretrvával približne 1 hodinu.

Diacylglycerol je potenciálny aktivátor dihydrátu pyrofosforečnanu vápenatého. Keďže kryštály OFC zvyšujú aktivitu fosfolipázy C, čo vedie k akumulácii diacylglycerolu, možno očakávať zvýšenie aktivácie PKC. PG Mitchell a kol. (1989) porovnávali účinky kryštálov OFC a PDGF na syntézu DNA _{fibroblastmi Balb/c-3T3}. V bunkovej kultúre bol PKC inaktivovaný inkubáciou buniek s forbolovým diesterom (TPD) podporujúcim nádor, čo je analóg diacylglycerolu. Dlhodobá stimulácia nízkymi dávkami TPD znížila aktivitu PKC, zatiaľ čo jednorazová stimulácia vysokou dávkou ju aktivovala. Stimulácia syntézy DNA kryštálmi OFC bola po inaktivácii PKC potlačená, čo naznačuje dôležitosť tohto enzýmu v mitogenéze indukovanej OFC. Predtým GM McCarthy a kol. (1987) preukázali súvislosť medzi mitogénnou odpoveďou ľudských fibroblastov na kryštály OFC a aktiváciou PKC. Kryštály OFC však neaktivujú fosfatidylinositol-3-kinázu ani tyrozínkinázy, čo potvrdzuje, že mechanizmus aktivácie buniek kryštálmi OFC je selektívny.

Bunková proliferácia je riadená skupinou génov nazývaných protoonkogény. Bielkoviny foe a mye, produkty protoonkogénov c-fos a c-myc, sú lokalizované v bunkovom jadre a viazané na špecifické sekvencie DNA. Stimulácia fibroblastov 3T3 kryštálmi OFC vedie k expresii c-fos v priebehu niekoľkých minút, ktorá dosahuje maximum 30 minút po stimulácii. Indukcia transkripcie c-myc kryštálmi OFC alebo PDGF nastáva do 1 hodiny a dosahuje maximum 3 hodiny po stimulácii. Bunky si udržiavajú zvýšenú hladinu transkripcie c-fos a c-myc najmenej 5 hodín. V bunkách s inaktivovanou PCD je stimulácia c-fos a c-myc kryštálmi OFC alebo TFD významne potlačená, zatiaľ čo indukcia týchto génov PDGF sa nemení.

Členovia rodiny mitogénom aktivovaných proteínkináz (MAP K) sú kľúčovými regulátormi rôznych intracelulárnych signálnych kaskád. Jedna podtrieda tejto rodiny, p42/p44, reguluje proliferáciu buniek prostredníctvom mechanizmu, ktorý zahŕňa aktiváciu protoonkogénov c-fos a c-jun. Kryštály OFC a PFKD aktivujú signálnu dráhu proteínkinázy, ktorá zahŕňa p42 aj p44, čo naznačuje úlohu tejto dráhy v mitogenéze indukovanej kryštálmi obsahujúcimi vápnik.

Nakoniec, mitogenéza indukovaná OFC zahŕňa transkripčný faktor nukleárny faktor κB (NF-κB), ktorý bol prvýkrát opísaný ako gén ľahkého reťazca imunoglobulínu κ (IgK). Je to indukovateľný transkripčný faktor dôležitý v mnohých signálnych dráhach, pretože reguluje expresiu rôznych génov. Indukcia NF-κB je zvyčajne spojená s uvoľňovaním inhibičných proteínov nazývaných IκB z cytoplazmy. Po indukcii NF-κB nasleduje translokácia aktívneho transkripčného faktora do jadra. Kryštály OFC indukujú NF-κB vo fibroblastoch Balb/c- _3T3 a fibroblastoch ľudskej kože.

Do signálnej transdukcie po aktivácii NF-κB môže byť zapojených niekoľko dráh, ale všetky zahŕňajú proteínkinázy, ktoré fosforylujú (a tým degradujú) IκB. Na základe štúdií in vitro sa predtým predpokladalo, že IκB slúži ako substrát pre kinázy (napr. PKC a proteínkinázu A). Nedávno však bol identifikovaný komplex kinázy IκB s veľkou molekulovou hmotnosťou. Tieto kinázy špecificky fosforylujú serínové zvyšky IκB. Aktivácia NF-κB pomocou TNF-α a IL-1 vyžaduje účinné pôsobenie kinázy indukujúcej NF-κB (NIK) a kinázy IκB. Molekulárny mechanizmus aktivácie NIK nie je v súčasnosti známy. Hoci kryštály OFC aktivujú PKC aj NF-κB, rozsah, v akom môžu byť tieto dva procesy prepojené, nie je známy. Keďže modifikácia kinázy GκB prebieha prostredníctvom fosforylácie, nemožno vylúčiť úlohu PKC v indukcii NF-κB kryštálmi OFC prostredníctvom fosforylácie a aktivácie kinázy GκB. Túto koncepciu podporuje inhibícia mitogenézy indukovanej kryštálmi OFC a expresie NF-κB inhibítorom PKC staurosporínom. Podobne môže staurosporín inhibovať kinázu GκB, a tým inhibovať proteínkinázu A a ďalšie proteínkinázy.

Mechanizmus mitogenézy indukovanej OFC kryštálmi vo fibroblastoch teda zahŕňa najmenej dva rôzne procesy:

• rýchla membránovo viazaná udalosť, ktorá vedie k aktivácii PKC a MAP K, indukcii NF-κB a protoonkogénov,
• pomalšie intracelulárne rozpúšťanie kryštálov, čo vedie k zvýšeniu intracelulárneho obsahu Ca2 ⁺ a následne k aktivácii množstva procesov závislých od vápnika, ktoré stimulujú mitogenézu.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

Indukcia kryštálmi obsahujúcimi MMP-vápnik

Mediátormi poškodenia tkaniva kryštálmi obsahujúcimi vápnik sú MMP - kolagenáza-1, stromelyzín, 92 kD želatináza a kolagenáza-3.

Vzhľadom na vzťah medzi obsahom kryštálov OFC a deštrukciou kĺbového tkaniva bola predložená hypotéza, že kryštály OFC a pravdepodobne aj niektoré kolagény sú fagocytované synoviálnymi bunkami. Stimulované synovocyty proliferujú a vylučujú proteázy. Táto hypotéza bola testovaná in vitro pridaním prírodných alebo syntetických OFC, PFCD a iných kryštálov do kultivovaných ľudských alebo psích synovocytov. Aktivita neutrálnych proteáz a kolagenáz sa zvyšovala v závislosti od dávky a bola približne 5 až 8-krát vyššia ako aktivita kontrolnej bunkovej kultúry pestovanej bez kryštálov.

V bunkách kultivovaných v médiu obsahujúcom kryštály bola detegovaná koindukcia mRNA kolagenázy-1, stromelyzínu a želatinázy-92 kDa, po ktorej nasledovala sekrécia enzýmov do média.

Kryštály OFC tiež indukovali akumuláciu mRNA kolagenázy-1 a kolagenázy-2 v zrelých bravčových chondrocytoch, po čom nasledovala sekrécia enzýmov do média.

GM McCarty a kol. (1998) študovali úlohu intracelulárneho rozpúšťania kryštálov v kryštálmi indukovanej produkcii MMP. Zvýšenie pH lyzozómov pomocou bafilomycínu A inhibovalo intracelulárne rozpúšťanie kryštálov a tiež zoslabilo proliferačnú odpoveď ľudských fibroblastov na kryštály OFC, ale neinhibovalo syntézu a sekréciu MMP.

Ani zásaditý fosforečnan vápenatý, ani kryštály PFCD neindukovali produkciu IL-1 in vitro, ale kryštály urátu sodného áno.

Súčasné údaje jasne naznačujú priamu stimuláciu produkcie MMP fibroblastmi a chondrocytmi pri kontakte s kryštálmi obsahujúcimi vápnik.

Príznaky osteoartrózy naznačujú významnú úlohu MMP v progresii ochorenia. Prítomnosť kryštálov obsahujúcich vápnik zvyšuje degeneráciu tkanív postihnutých kĺbov.

Stimulácia syntézy prostaglandínov

Spolu so stimuláciou rastu buniek a sekréciou enzýmov spôsobujú kryštály obsahujúce vápnik uvoľňovanie prostaglandínov, najmä PGE2, z bunkových kultúr cicavcov _. Uvoľňovanie PGE2 _vo všetkých prípadoch nastáva v priebehu prvej hodiny po vystavení buniek kryštálom. R. Rothenberg (1987) zistil, že hlavnými zdrojmi kyseliny arachidónovej pre syntézu PGE2 _sú fosfatidylcholín a fosfatidyletanolamín a tiež potvrdil, že fosfolipáza A2 _a NOX sú dominantnými dráhami pre _produkciu PGE2.

PGE1 sa môže uvoľňovať aj v reakcii na kryštály OFA. GM McCarty a kol. (1993, 1994) študovali účinky PGE2 _, PGE a jeho analógu misoprostolu na mitogénnu odpoveď ľudských fibroblastov na kryštály OFA. Všetky tri látky inhibovali mitogénnu odpoveď dávkovo závislým spôsobom, pričom PGE a misoprostol vykazovali výraznejšiu inhibičnú aktivitu. PGE2 a misoprostol, ale nie PGE2 _, inhibovali akumuláciu mRNA kolagenázy v reakcii na kryštály OFA.

MG McCarty a H. Cheung (1994) skúmali mechanizmus aktivácie buniek sprostredkovanej OFC pomocou PGE. Autori preukázali, že PGE, silnejší induktor intracelulárneho cAMP ako PGE2 _a PGE, inhibuje OFC-indukovanú mitogenézu a produkciu MMP prostredníctvom cAMP-dependentnej signálnej transdukčnej dráhy. Je možné, že zvýšenie produkcie PGE indukované kryštálmi OFC oslabuje ich ďalšie biologické účinky (mitogenézu a produkciu MMP) prostredníctvom mechanizmu spätnej väzby.

Zápal vyvolaný kryštálmi

Kryštály obsahujúce vápnik sa často nachádzajú v synoviálnej tekutine pacientov s osteoartrózou, avšak epizódy akútneho zápalu s leukocytózou sú zriedkavé pri osteoartróze aj pri artropatiách spojených s kryštálmi (napríklad Milwaukeeov syndróm ramena). Flogistický potenciál kryštálov môže byť modifikovaný množstvom inhibičných faktorov. R. Terkeltaub a kol. (1988) preukázali schopnosť krvného séra a plazmy významne inhibovať reakciu neutrofilných granulocytov na zásadité kryštály fosforečnanu vápenatého. Faktormi, ktoré spôsobujú takúto inhibíciu, sú proteíny viažuce kryštály. Štúdia jedného z týchto proteínov, ₂ -HS glykoproteínu (AHSr), ukázala, že AHSr je najúčinnejším a najšpecifickejším inhibítorom reakcie neutrofilných granulocytov na kryštály OFC. AHSr je sérový proteín pečeňového pôvodu; Je známe, že v porovnaní s inými sérovými proteínmi sa nachádza v relatívne vysokých koncentráciách v kostiach a mineralizujúcom tkanive. Okrem toho je AHSr prítomný v „nezapálenej“ synoviálnej tekutine a bol detegovaný aj na zásaditých kryštáloch fosforečnanu vápenatého v natívnej synoviálnej tekutine. Preto nemožno vylúčiť možnosť, že AHSr moduluje flogogenný potenciál kryštálov zásaditého fosforečnanu vápenatého in vivo.

Aby sme zhrnuli všetky vyššie uvedené skutočnosti, uvádzame dve schémy patogenézy osteoartrózy navrhnuté WB van den Bergom a kol. (1999) a M. Carrabba a kol. (1996), ktoré kombinujú mechanické, genetické a biochemické faktory.