Krvotvorné kmeňové bunky

Hematopoetické kmeňové bunky (HSC), podobne ako mezenchymálne progenitorové bunky, sa vyznačujú multipotenciou a dávajú vznik bunkovým líniám, ktorých konečné elementy tvoria formované elementy krvi, ako aj množstvu špecializovaných tkanivových buniek imunitného systému.

Hypotéza o existencii spoločného prekurzora všetkých krvných buniek, ako aj samotný termín „kmeňová bunka“, patrí A. Maksimovovi (1909). Potenciál pre tvorbu bunkovej hmoty v HSC je obrovský - kmeňové bunky kostnej drene denne produkujú 10 buniek, ktoré tvoria formované prvky periférnej krvi. Samotná skutočnosť existencie hematopoetických kmeňových buniek bola stanovená v roku 1961 v experimentoch na obnovenie hematopoézy u myší, ktoré dostali smrteľnú dávku rádioaktívneho ožiarenia, ktoré ničí kmeňové bunky kostnej drene. Po transplantácii syngénnych buniek kostnej drene takýmto letálne ožiareným zvieratám sa v slezine príjemcov našli samostatné ložiská hematopoézy, ktorých zdrojom boli jednotlivé klonogénne prekurzorové bunky.

Následne bola dokázaná schopnosť hematopoetických kmeňových buniek k samoudržiavaniu, zabezpečovaniu funkcie hematopoézy v procese ontogenézy. V procese embryonálneho vývoja sa HSC vyznačujú vysokou migračnou aktivitou, ktorá je nevyhnutná pre ich pohyb do zón tvorby hematopoetických orgánov. Táto vlastnosť HSC sa zachováva aj v ontogenéze - vďaka ich neustálej migrácii dochádza k neustálej obnove zásoby imunokompetentných buniek. Schopnosť HSC migrovať, prenikať cez histohematické bariéry, implantovať sa do tkanív a klonogénne rásť slúžila ako základ pre transplantáciu buniek kostnej drene pri rade ochorení spojených s patológiou hematopoetického systému.

Tak ako všetky zdroje kmeňových buniek, aj hematopoetické kmeňové bunky sú vo svojej nike (kostná dreň) prítomné vo veľmi malých množstvách, čo spôsobuje určité ťažkosti pri ich izolácii. Imunofenotypicky sú ľudské HSC charakterizované ako CD34+NK bunky schopné migrovať do krvného obehu a osídľovať orgány imunitného systému alebo repopulovať strómu kostnej drene. Malo by byť jasné, že HSC nie sú najnezrelejšie bunky kostnej drene, ale pochádzajú z prekurzorov, medzi ktoré patria dormantne CD34-negatívne bunky podobné fibroblastom. Bolo zistené, že bunky s fenotypom CD34 sú schopné vstúpiť do krvného obehu, kde zmenia svoj fenotyp na CD34+, ale po spätnej migrácii do kostnej drene sa pod vplyvom mikroprostredia opäť stanú CD34-negatívnymi prvkami kmeňových buniek. V pokojovom stave CD34~ bunky nereagujú na parakrinné regulačné signály strómy (rastové faktory, cytokíny). Avšak v situáciách vyžadujúcich zvýšenú intenzitu hematopoézy reagujú kmeňové bunky s fenotypom CD34 na diferenciačné signály tvorbou hematopoetických aj mezenchymálnych progenitorových buniek. Hematopoéza prebieha priamym kontaktom HSC s bunkovými prvkami strómy kostnej drene, ktorú predstavuje komplexná sieť makrofágov, retikulárnych endotelových buniek, osteoblastov, stromálnych fibroblastov a extracelulárnej matrice. Stromálny základ kostnej drene nie je len matricou alebo „kostrou“ pre hematopoetické tkanivo; vykonáva jemnú reguláciu hematopoézy v dôsledku parakrinných regulačných signálov rastových faktorov, cytokínov a chemokínov a tiež zabezpečuje adhézne interakcie potrebné na tvorbu krviniek.

Neustále sa obnovujúci systém hematopoézy je teda založený na polypotentnej (z hľadiska hematopoézy) hematopoetickej kmeňovej bunke schopnej dlhodobej samoudržiavania. V procese viazania (commitmentu) HSC podliehajú primárnej diferenciácii a tvoria klony buniek, ktoré sa líšia cytomorfologickými a imunofenotypickými charakteristikami. Postupná tvorba primitívnych a viazaných progenitorových buniek končí tvorbou morfologicky identifikovateľných progenitorových buniek rôznych hematopoetických línií. Výsledkom následných štádií komplexného viacstupňového procesu hematopoézy je dozrievanie buniek a uvoľňovanie zrelých formovaných prvkov do periférnej krvi - erytrocytov, leukocytov, lymfocytov a trombocytov.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

Zdroje hematopoetických kmeňových buniek

Hematopoetické kmeňové bunky sa považujú za najštudovanejší zdroj kmeňových buniek, čo je do značnej miery spôsobené ich klinickým využitím pri transplantácii kostnej drene. Na prvý pohľad sa o týchto bunkách vie pomerne veľa. Do istej miery je to pravda, keďže stredne pokročilí a zrelí potomkovia HSC sú najdostupnejšími bunkovými prvkami, z ktorých každý (erytrocyty, leukocyty, lymfocyty, monocyty/makrofágy a krvné doštičky) bol starostlivo študovaný na všetkých úrovniach - od svetelnej po elektrónovú mikroskopiu, od biochemických a imunofenotypových charakteristík až po identifikáciu metódami PCR analýzy. Monitorovanie morfologických, ultraštrukturálnych, biochemických, imunofenotypových, biofyzikálnych a genomických parametrov HSC však neposkytlo odpovede na mnohé problematické otázky, ktorých riešenie je nevyhnutné pre rozvoj bunkovej transplantológie. Mechanizmy stabilizácie hematopoetických kmeňových buniek v dormantnom stave, ich aktivácie, vstupu do štádia symetrického alebo asymetrického delenia a čo je najdôležitejšie, angažovanosti pri tvorbe takých funkčne odlišných krvných prvkov, ako sú erytrocyty, leukocyty, lymfocyty a krvné doštičky, ešte neboli stanovené.

Prítomnosť buniek s fenotypom CD34 v kostnej dreni, ktoré sú progenitormi mezenchymálnych aj hematopoetických kmeňových buniek, vyvolala otázku existencie najskorších prekurzorov bunkovej diferenciácie do stromálnych a hematopoetických línií, blízkych CD34-negatívnym bunkám. Metódou dlhodobej kultivácie boli získané takzvané bunky iniciujúce dlhodobú kultiváciu (LTC-IC). Životnosť takýchto prekurzorových buniek s aktivitou tvorby kolónií na stromálnom základe kostnej drene s určitou kombináciou rastových faktorov presahuje 5 týždňov, zatiaľ čo životaschopnosť viazaných jednotiek tvoriacich kolónie (CFU) v kultúre je iba 3 týždne. V súčasnosti sa LTC-IC považuje za funkčný analóg HSC, pretože s vysokým repopulačným potenciálom sa približne 20 % LTC-IC vyznačuje fenotypom CD34+CD38- a vykazuje vysokú schopnosť samoobnovy. Takéto bunky sa nachádzajú v ľudskej kostnej dreni s frekvenciou 1:50 000. Avšak bunky iniciujúce myeloidné lymfoidy, ktoré sa získavajú za dlhodobých (15 týždňov) kultivačných podmienok, by mali byť považované za najbližšie k HSC. Takéto bunky, označené ako LTC, patria medzi bunky kostnej drene ľudského mozgu, vyskytujú sa 10-krát menej často ako LTC-IC a tvoria bunkové línie myeloidnej aj lymfoidnej hematopoetickej línie.

Hoci značenie hematopoetických kmeňových buniek monoklonálnymi protilátkami s následnou imunofenotypovou identifikáciou je hlavnou metódou rozpoznávania a selektívneho triedenia hematopoetických buniek s kmeňovým potenciálom, klinické využitie takto izolovaných HSC je obmedzené. Blokovanie receptora CD34 alebo iných markerových antigénov protilátkami počas imunopozitívneho triedenia nevyhnutne mení vlastnosti bunky izolovanej s jeho pomocou. Imunonegatívna izolácia HSC na magnetických kolónach sa považuje za výhodnejšiu. V tomto prípade sa však na triedenie zvyčajne používajú monoklonálne protilátky fixované na kovovom nosiči. Okrem toho, čo je dôležité, obe metódy izolácie HSC sú založené skôr na fenotypových ako funkčných charakteristikách. Preto mnohí výskumníci uprednostňujú analýzu klonogénnych parametrov HSC, ktorá umožňuje určiť stupeň zrelosti a smer diferenciácie progenitorových buniek podľa veľkosti a zloženia kolónií. Je známe, že počas procesu viazania sa počet buniek a ich typy v kolónii znižujú. Hematopoetická kmeňová bunka a jej skorá dcérska bunka, nazývaná „jednotka tvoriaca kolónie granulocytov-erytrocytov-monocytov-megakaryocytov“ (CFU-GEMM), vytvárajú v kultúre veľké viaclíniové kolónie obsahujúce granulocyty, erytrocyty, monocyty a megakaryocyty. Jednotka tvoriaca kolónie granulocytov-monocytov (CFU-GM), ktorá sa nachádza pozdĺž línie záväznosti, tvorí kolónie granulocytov a makrofágov a jednotka tvoriaca kolónie granulocytov (CFU-G) tvorí iba malú kolóniu zrelých granulocytov. Skorý prekurzor erytrocytov, jednotka erytrocytov tvoriaca výbuch (CFU-E), je zdrojom veľkých erytrocytových kolónií a zrelšia jednotka tvoriaca kolónie erytrocytov (CFU-E) je zdrojom malých erytrocytových kolónií. Vo všeobecnosti, keď bunky rastú na polotuhom médiu, možno identifikovať bunky, ktoré tvoria šesť typov myeloidných kolónií: CFU-GEMM, CFU-GM, CFU-G, CFU-M, BFU-E a CFU-E).

Avšak okrem hematopoetických derivátov obsahuje akýkoľvek východiskový materiál na izoláciu HSC značný počet sprievodných buniek. V tomto ohľade je potrebné predbežné čistenie transplantátu, predovšetkým od aktívnych buniek imunitného systému darcu. Na tento účel sa zvyčajne používa imunoselekcia založená na expresii špecifických antigénov lymfocytmi, čo umožňuje ich izoláciu a odstránenie pomocou monoklonálnych protilátok. Okrem toho bola vyvinutá imunorozetová metóda deplécie T-lymfocytov z transplantátu kostnej drene, ktorá je založená na tvorbe komplexov CD4+ lymfocytov a špecifických monoklonálnych protilátok, ktoré sa účinne odstraňujú pomocou aferézy. Táto metóda zabezpečuje produkciu purifikovaného bunkového materiálu so 40 – 60 % obsahom hematopoetických kmeňových buniek.

Zvýšenie počtu progenitorových buniek v dôsledku odstránenia zrelých krvných elementov z produktu leukaferézy sa dosahuje protiprúdovou centrifugáciou, po ktorej nasleduje filtrácia (v prítomnosti chelátora - citrátu trisodného) cez kolóny obsahujúce nylonové vlákna potiahnuté ľudským imunoglobulínom. Postupné použitie týchto dvoch metód zabezpečuje úplné čistenie transplantátu od krvných doštičiek, 89 % od erytrocytov a 91 % od leukocytov. Vďaka významnému zníženiu straty HSC sa môže hladina CD34+ buniek v celkovej bunkovej hmote zvýšiť až na 50 %.

Schopnosť izolovaných hematopoetických kmeňových buniek tvoriť kolónie zrelých krviniek v kultúre sa využíva na funkčnú charakterizáciu buniek. Analýza vytvorených kolónií umožňuje identifikovať a kvantifikovať typy progenitorových buniek, stupeň ich väzby a stanoviť smer ich diferenciácie. Klonogénna aktivita sa stanovuje v polotuhých médiách na metylcelulóze, agare, plazme alebo fibrínovom géli, ktoré znižujú migračnú aktivitu buniek a bránia ich prichyteniu na povrch skla alebo plastu. Za optimálnych kultivačných podmienok sa klony vyvinú z jednej bunky za 7 – 18 dní. Ak klon obsahuje menej ako 50 buniek, identifikuje sa ako jeden zhluk; ak počet buniek presiahne 50, identifikuje sa ako kolónia. Zohľadňuje sa počet buniek schopných vytvoriť kolóniu (jednotky tvoriace kolónie – CFU alebo bunky tvoriace kolónie – COC). Treba poznamenať, že parametre CFU a COC nezodpovedajú počtu HSC v bunkovej suspenzii, hoci s ním korelujú, čo opäť zdôrazňuje potrebu stanoviť funkčnú (kolónie tvoriacu) aktivitu HSC in vitro.

Spomedzi buniek kostnej drene majú hematopoetické kmeňové bunky najvyšší proliferačný potenciál, vďaka čomu tvoria v kultúre najväčšie kolónie. Počet takýchto kolónií sa navrhuje na nepriame určenie počtu kmeňových buniek. Po vytvorení kolónií in vitro s priemerom presahujúcim 0,5 mm a počtom buniek viac ako 1000 autori testovali takéto bunky na rezistenciu voči subletálnym dávkam 5-fluóruracilu a skúmali ich schopnosť repopulovať kostnú dreň letálne ožiarených zvierat. Podľa špecifikovaných parametrov boli izolované bunky takmer nerozoznateľné od HSC a dostali skratku HPP-CFC - kolónie tvoriace bunky s vysokým proliferačným potenciálom.

Hľadanie kvalitnejšej izolácie hematopoetických kmeňových buniek pokračuje. Hematopoetické kmeňové bunky sú však morfologicky podobné lymfocytom a predstavujú relatívne homogénny súbor buniek s takmer okrúhlymi jadrami, jemne rozptýleným chromatínom a malým množstvom slabo bazofilnej cytoplazmy. Ich presný počet je tiež ťažké určiť. Predpokladá sa, že HSC v ľudskej kostnej dreni sa vyskytujú s frekvenciou 1 na 106 jadrových buniek.

Identifikácia hematopoetických kmeňových buniek

Na zlepšenie kvality identifikácie hematopoetických kmeňových buniek sa vykonáva sekvenčná alebo simultánna (na viackanálovom triediči) štúdia spektra membránovo viazaných antigénov a v HSC by mal byť fenotyp CD34+CD38 kombinovaný s absenciou lineárnych diferenciačných markerov, najmä antigénov imunokompetentných buniek, ako je CD4, povrchové imunoglobulíny a glykoforín.

Takmer všetky schémy fenotypizácie hematopoetických kmeňových buniek zahŕňajú stanovenie antigénu CD34. Tento glykoproteín s molekulovou hmotnosťou približne 110 kDa, nesúci niekoľko glykozylačných miest, sa exprimuje na membráne plazmatických buniek po aktivácii zodpovedajúceho génu lokalizovaného na chromozóme 1. Funkcia molekuly CD34 je spojená s interakciou skorých hematopoetických progenitorových buniek so stromálnou bázou kostnej drene sprostredkovanou L-selektínom. Treba však mať na pamäti, že prítomnosť antigénu CD34 na povrchu buniek umožňuje len predbežné posúdenie obsahu HSC v bunkovej suspenzii, pretože ho exprimujú aj iné hematopoetické progenitorové bunky, ako aj stromálne bunky kostnej drene a endotelové bunky.

Počas diferenciácie hematopoetických progenitorových buniek je expresia CD34 trvalo znížená. Erytrocytové, granulocytové a monocytové viazané progenitorové bunky buď slabo exprimujú antigén CD34, alebo ho vôbec neexprimujú na svojom povrchu (fenotyp CD34). Antigén CD34 sa nedeteguje na povrchovej membráne diferencovaných buniek kostnej drene a zrelých krviniek.

Treba poznamenať, že v dynamike diferenciácie hematopoetických progenitorových buniek sa nielen znižuje úroveň expresie CD34, ale progresívne sa zvyšuje aj expresia antigénu CD38, integrálneho membránového glykoproteínu s molekulovou hmotnosťou 46 kDa, ktorý má aktivitu NAD-glykohydrolázy a ADP-ribozylcyklázy, čo naznačuje jeho účasť na transporte a syntéze ADP-ribózy. Objavuje sa teda možnosť dvojitej kontroly stupňa viazanosti hematopoetických progenitorových buniek. Populácia buniek s fenotypom CD34+CD38+, ktorá tvorí 90 až 99 % CD34-pozitívnych buniek kostnej drene, obsahuje progenitorové bunky s obmedzeným proliferačným a diferenciačným potenciálom, zatiaľ čo bunky s fenotypom CD34+CD38 si môžu nárokovať úlohu HSC.

Populácia buniek kostnej drene opísaná vzorcom CD34+CD38- skutočne obsahuje relatívne veľký počet primitívnych kmeňových buniek schopných diferenciácie v myeloidnom a lymfoidnom smere. Za podmienok dlhodobej kultivácie buniek s fenotypom CD34+CD38- je možné získať všetky zrelé krvné elementy: neutrofily, eozinofily, bazofily, monocyty, megakaryocyty, erytrocyty a lymfocyty.

Relatívne nedávno sa zistilo, že CD34-pozitívne bunky exprimujú ďalšie dva markery, AC133 a CD90 (Thy-1), ktoré sa tiež používajú na identifikáciu hematopoetických kmeňových buniek. Antigén Thy-1 je koexprimovaný s receptorom CD117 (c-kit) na CD34+ bunkách kostnej drene, pupočníkovej šnúry a periférnej krvi. Ide o povrchový glykoproteín viažuci fosfatidylinozitol s molekulovou hmotnosťou 25 – 35 kDa, ktorý sa zúčastňuje procesov bunkovej adhézie. Niektorí autori sa domnievajú, že antigén Thy-1 je markerom najnezrelejších CD34-pozitívnych buniek. Samoreprodukujúce sa bunky s fenotypom CD34+Thy-1+ dávajú vznik dlhodobo kultivovaným líniám s tvorbou dcérskych buniek. Predpokladá sa, že antigén Thy-1 blokuje regulačné signály, ktoré spôsobujú zastavenie bunkového delenia. Napriek tomu, že bunky CD34+Thy1+ sú schopné samoreprodukcie a tvorby dlhodobo kultivovaných línií, ich fenotyp nemožno pripísať výlučne HSC, keďže obsah Thy-1+ v celkovej hmotnosti CD34-pozitívnych bunkových elementov je približne 50 %, čo výrazne prevyšuje počet hematopoetických buniek.

Sľubnejším pre identifikáciu hematopoetických kmeňových buniek by mal byť AC133 - antigénny marker hematopoetických progenitorových buniek, ktorého expresia bola prvýkrát detegovaná na embryonálnych pečeňových bunkách. AC133 je transmembránový glykoproteín, ktorý sa objavuje na povrchu bunkovej membrány v najskorších štádiách dozrievania HSC - je možné, že ešte skôr ako antigén CD34. V štúdiách A. Petrenka a V. Grishčenka (2003) sa zistilo, že AC133 exprimuje až 30 % CD34-pozitívnych embryonálnych pečeňových buniek.

Ideálny fenotypový profil hematopoetických kmeňových buniek teda podľa súčasných koncepcií pozostáva z bunkového obrysu, ktorého kontúry by mali zahŕňať konfigurácie antigénov CD34, AC133 a Thy-1, ale nie je tam miesto pre molekulárne projekcie CD38, HLA-DR a lineárne diferenciačné markery GPA, CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20.

Variáciou fenotypového portrétu HSC môže byť kombinácia CD34+CD45RalowCD71low, keďže vlastnosti buniek opísaných týmto vzorcom sa nelíšia od funkčných parametrov buniek s fenotypom CD34+CD38. Okrem toho možno ľudské HSC identifikovať podľa fenotypových znakov CD34+Thy-l+CD38Iow/'c-kit/low - iba 30 takýchto buniek úplne obnoví hematopoézu u letálne ožiarených myší.

Štyridsaťročné obdobie intenzívneho výskumu HSC, ktoré sú schopné samoreprodukcie aj diferenciácie na iné bunkové prvky, sa začalo analýzou všeobecných fenotypových charakteristík buniek kostnej drene, čo umožnilo odôvodniť použitie transplantácie kostnej drene na liečbu rôznych patológií hematopoetického systému. Nové typy kmeňových buniek objavené neskôr sa zatiaľ v klinickej praxi široko nepoužívajú. Zároveň sú kmeňové bunky pupočníkovej krvi a embryonálnej pečene schopné výrazne rozšíriť rozsah transplantácie buniek nielen v hematológii, ale aj v iných oblastiach medicíny, pretože sa od HSC kostnej drene líšia kvantitatívnymi aj kvalitatívnymi znakmi.

Objem hmoty hematopoetických kmeňových buniek potrebný na transplantáciu sa zvyčajne získava z kostnej drene, periférnej a pupočníkovej krvi a embryonálnej pečene. Okrem toho je možné hematopoetické progenitorové bunky získať in vitro rozmnožením embryonálnych kmeňových buniek (ESC) s ich následnou riadenou diferenciáciou na hematopoetické bunkové elementy. A. Petrenko, V. Grishchenko (2003) správne poznamenávajú významné rozdiely v imunologických vlastnostiach a schopnosti obnoviť hematopoézu HSC rôzneho pôvodu, čo je spôsobené nerovnomerným pomerom skorých pluripotentných a neskorých progenitorových buniek obsiahnutých v ich zdrojoch. Okrem toho sa hematopoetické kmeňové bunky získané z rôznych kmeňových zdrojov vyznačujú kvantitatívne a kvalitatívne úplne odlišnými asociáciami nehematopoetických buniek.

Kostná dreň sa už stala tradičným zdrojom hematopoetických kmeňových buniek. Suspenzia buniek kostnej drene sa získava z bedrovej alebo hrudnej kosti premytím v lokálnej anestézii. Takto získaná suspenzia je heterogénna a obsahuje zmes HSC, stromálnych bunkových elementov, progenitorových buniek myeloidnej a lymfoidnej línie, ako aj zrelých krvných elementov. Počet buniek s fenotypmi CD34+ a CD34+CD38 medzi mononukleárnymi bunkami kostnej drene je 0,5 – 3,6 %, respektíve 0 – 0,5 %. Periférna krv po mobilizácii HSC indukovanej G-CSF obsahuje 0,4 – 1,6 % CD34+ a 0 – 0,4 % CD34+CD38.

Percento buniek s imunofenotypmi CD34+CD38 a CD34+ je vyššie v pupočníkovej krvi – 0 – 0,6 a 1 – 2,6 % a ich maximálny počet sa zistil medzi hematopoetickými bunkami embryonálnej pečene – 0,2 – 12,5 a 2,3 – 35,8 %.

Kvalita transplantovaného materiálu však nezávisí len od počtu buniek CD34+, ktoré obsahuje, ale aj od ich funkčnej aktivity, ktorú možno posúdiť úrovňou tvorby kolónií in vivo (repopulácia kostnej drene u letálne ožiarených zvierat) a in vitro - rastom kolónií na polotekutom médiu. Ukázalo sa, že aktivita tvorby kolónií a proliferácia hematopoetických progenitorových buniek s fenotypom CD34+CD38 HLA-DR izolovaných z embryonálnej pečene, fetálnej kostnej drene a pupočníkovej krvi výrazne prevyšuje proliferačný a kolónie tvoriaci potenciál hematopoetických buniek kostnej drene a periférnej krvi dospelého. Kvantitatívna a kvalitatívna analýza HSC rôzneho pôvodu odhalila významné rozdiely v ich relatívnom obsahu v bunkovej suspenzii aj vo funkčných schopnostiach. Maximálny počet buniek CD34+ (24,6 %) bol zistený v transplantovanom materiáli získanom z fetálnej kostnej drene. Kostná dreň dospelého obsahuje 2,1 % bunkových elementov pozitívnych na CD34. Medzi mononukleárnymi bunkami periférnej krvi dospelého človeka má iba 0,5 % fenotyp CD34+, zatiaľ čo v pupočníkovej krvi ich počet dosahuje 2 %. Zároveň je schopnosť tvoriť kolónie buniek CD34+ fetálnej kostnej drene 2,7-krát vyššia ako klonálna rastová kapacita hematopoetických buniek kostnej drene dospelého človeka a bunky pupočníkovej krvi tvoria výrazne viac kolónií ako hematopoetické elementy izolované z periférnej krvi dospelých: 65,5 a 40,8 kolónií/105 buniek.

Rozdiely v proliferačnej aktivite a schopnosti tvoriť kolónie hematopoetických kmeňových buniek sú spojené nielen s rôznym stupňom ich zrelosti, ale aj s ich prirodzeným mikroprostredím. Je známe, že intenzita proliferácie a rýchlosť diferenciácie kmeňových buniek sú určené integrálnym regulačným účinkom viaczložkového systému rastových faktorov a cytokínov, ktoré sú produkované samotnými kmeňovými bunkami, ako aj bunkovými prvkami ich matrix-stromálneho mikroprostredia. Použitie purifikovaných bunkových populácií a bezsérových médií na kultiváciu buniek umožnilo charakterizovať rastové faktory, ktoré majú stimulačný a inhibičný účinok na kmeňové bunky rôznych úrovní, progenitorové bunky a bunky viazané v jednom alebo druhom lineárnom smere. Výsledky štúdií presvedčivo naznačujú, že HSC získané zo zdrojov s rôznymi úrovňami ontogenetického vývoja sa líšia fenotypovo aj funkčne. HSC v skorších štádiách ontogenézy sa vyznačujú vysokým sebareprodukčným potenciálom a vysokou proliferačnou aktivitou. Takéto bunky sa vyznačujú dlhšími telomérami a podliehajú viazaniu na všetky hematopoetické bunkové línie. Reakcia imunitného systému na HSC embryonálneho pôvodu je oneskorená, pretože takéto bunky slabo exprimujú molekuly HLA. Existuje jasná gradácia relatívneho obsahu HSC, ich schopnosti samoobnovy a počtu typov záväzných línií, ktoré tvoria: CD34+ bunky embryonálnej pečene > CD34+ bunky pupočníkovej krvi > CD34+ bunky kostnej drene. Je dôležité, že tieto rozdiely sú vlastné nielen intra-, neo- a skorému postnatálnemu obdobiu ľudského vývoja, ale aj celej ontogenéze - proliferačná a kolónie tvoriaca aktivita HSC získaných z kostnej drene alebo periférnej krvi dospelého je nepriamo úmerná veku darcu.