Krvotvorné kmeňové bunky žĺtkového vaku

Je zrejmé, že rôzne proliferačné a diferenciačné potenciály hematopoetických kmeňových buniek sú určené zvláštnosťami ich ontogenetického vývoja, pretože aj lokalizácia hlavných oblastí hematopoézy sa u ľudí počas ontogenézy mení. Hematopoetické progenitorové bunky fetálneho žĺtkového vaku sú viazané na tvorbu výlučne erytropoetickej bunkovej línie. Po migrácii primárnych HSC do pečene a sleziny sa spektrum viazaných línií v mikroprostredí týchto orgánov rozširuje. Najmä hematopoetické kmeňové bunky získavajú schopnosť generovať bunky lymfoidnej línie. V prenatálnom období dosiahnu hematopoetické progenitorové bunky zónu konečnej lokalizácie a osídlia kostnú dreň. Počas vnútromaternicového vývoja obsahuje fetálna krv významný počet hematopoetických kmeňových buniek. Napríklad v 13. týždni tehotenstva dosahuje hladina HSC 18 % z celkového počtu mononukleárnych krviniek. Následne sa pozoruje progresívny pokles ich obsahu, ale ešte pred narodením sa množstvo HSC v pupočníkovej krvi len málo líši od ich množstva v kostnej dreni.

Podľa klasických konceptov sa prirodzená zmena lokalizácie hematopoézy počas embryonálneho vývoja cicavcov uskutočňuje migráciou a zavedením pluripotentných hematopoetických kmeňových buniek do nového mikroprostredia - zo žĺtkového vaku do pečene, sleziny a kostnej drene. Keďže v raných štádiách embryonálneho vývoja obsahuje hematopoetické tkanivo veľké množstvo kmeňových buniek, ktoré sa s dozrievaním plodu znižuje, za najsľubnejšie na získanie hematopoetických kmeňových buniek sa považuje hematopoetické tkanivo embryonálnej pečene, izolované z potrateného materiálu v 5. až 8. týždni tehotenstva.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Otázky o pôvode hematopoetických kmeňových buniek

Niet pochýb o tom, že embryonálna tvorba erytrocytov vzniká v krvných ostrovčekoch žĺtkového vaku. Diferenciačný potenciál hematopoetických buniek žĺtkového vaku in vitro je však veľmi obmedzený (diferencujú sa prevažne na erytrocyty). Treba poznamenať, že transplantácia hematopoetických kmeňových buniek žĺtkového vaku nie je schopná dlhodobo obnoviť hematopoézu. Ukázalo sa, že tieto bunky nie sú prekurzormi dospelých HSC. Skutočné HSC sa objavujú skôr, v 3. až 5. týždni intrauterinného vývoja, v zóne tvorby žalúdočného tkaniva a endotelu ciev (paraaortálna splanchnopleura, P-SP), ako aj v mieste aorty, pohlavných žliaz a primárnych obličiek - v mezonefros alebo tzv. oblasti AGM. Ukázalo sa, že bunky oblasti AGM sú zdrojom nielen HSC, ale aj endotelových buniek ciev, ako aj osteoklastov zapojených do procesov tvorby kostného tkaniva. V 6. týždni tehotenstva sa skoré hematopoetické progenitorové bunky z oblasti AGM presúvajú do pečene, ktorá zostáva hlavným hematopoetickým orgánom plodu až do narodenia.

Keďže tento bod je z hľadiska bunkovej transplantácie mimoriadne dôležitý, problém pôvodu HSC v procese ľudskej embryogenézy si zaslúži podrobnejšie predstavenie. Klasické predstavy o tom, že hematopoetické kmeňové bunky cicavcov a vtákov pochádzajú z extraembryonálneho zdroja, sú založené na štúdiách Metcalfa a Moora, ktorí ako prví použili metódy klonovania HSC a ich potomkov izolovaných zo žĺtkového vaku. Výsledky ich práce slúžili ako základ pre migračnú teóriu, podľa ktorej HSC, ktoré sa prvýkrát objavili v žĺtkovom vaku, postupne osídľujú prechodné a definitívne hematopoetické orgány, keďže sa v nich vytvára zodpovedajúce mikroprostredie. Takto sa vytvoril názor, že tvorba HSC, pôvodne lokalizovaných v žĺtkovom vaku, slúži ako bunkový základ pre definitívnu hematopoézu.

Progenitorové hematopoetické bunky žĺtkového vaku patria do kategórie najstarších progenitorových hematopoetických buniek. Ich fenotyp je opísaný vzorcom AA4.1+CD34+c-kit+. Na rozdiel od zrelých HSC kostnej drene neexprimujú antigény Sca-1 a molekuly MHC. Zdá sa, že výskyt markerových antigénov na povrchových membránach HSC žĺtkového vaku počas kultivácie zodpovedá ich diferenciácii počas embryonálneho vývoja s tvorbou viazaných hematopoetických línií: hladina expresie antigénov CD34 a Thy-1 klesá, expresia CD38 a CD45RA sa zvyšuje a objavujú sa molekuly HLA-DR. S následnou špecializáciou in vitro indukovanou cytokínmi a rastovými faktormi začína expresia antigénov špecifických pre progenitorové hematopoetické bunky určitej bunkovej línie. Výsledky štúdia embryonálnej hematopoézy u zástupcov troch tried stavovcov (obojživelníky, vtáky a cicavce) a najmä analýza pôvodu HSC zodpovedných za definitívnu hematopoézu v postnatálnej ontogenéze však protirečia klasickým koncepciám. Bolo zistené, že u zástupcov všetkých uvažovaných tried sa počas embryogenézy tvoria dve nezávislé oblasti, v ktorých vznikajú HSC. Extraembryonálna „klasická“ oblasť je reprezentovaná žĺtkovým vakom alebo jeho analógmi, zatiaľ čo nedávno identifikovaná intraembryonálna zóna lokalizácie HSC zahŕňa paraaortálny mezenchým a oblasť AGM. Dnes možno tvrdiť, že u obojživelníkov a vtákov pochádzajú definitívne HSC z intraembryonálnych zdrojov, zatiaľ čo u cicavcov a ľudí nemožno účasť HSC žĺtkového vaku na definitívnej hematopoéze úplne vylúčiť.

Embryonálna hematopoéza v žĺtkovom vaku je v skutočnosti primárna erytropoéza, ktorá sa vyznačuje zachovaním jadra vo všetkých štádiách dozrievania erytrocytov a syntézou hemoglobínu fetálneho typu. Podľa najnovších údajov vlna primárnej erytropoézy končí v žĺtkovom vaku na 8. deň embryonálneho vývoja. Nasleduje obdobie akumulácie definitívnych erytroidných progenitorových buniek - BFU-E, ktoré sa tvoria výlučne v žĺtkovom vaku a prvýkrát sa objavujú na 9. deň tehotenstva. V ďalšom štádiu embryogenézy sú už vytvorené definitívne erytroidné progenitorové bunky - CFU-E, ako aj (!) mastocyty a CFU-GM. To je základ pre názor, že definitívne progenitorové bunky vznikajú v žĺtkovom vaku, migrujú s krvným obehom, usadzujú sa v pečeni a rýchlo iniciujú prvú fázu intraembryonálnej hematopoézy. Podľa týchto konceptov možno žĺtkový vak považovať na jednej strane za miesto primárnej erytropoézy a na druhej strane za prvý zdroj definitívnych hematopoetických progenitorových buniek v embryonálnom vývoji.

Bolo preukázané, že bunky tvoriace kolónie s vysokým proliferačným potenciálom je možné izolovať zo žĺtkového vaku už na 8. deň tehotenstva, t. j. dlho pred uzavretím cievneho systému embrya a žĺtkového vaku. Navyše bunky s vysokým proliferačným potenciálom získané zo žĺtkového vaku in vitro tvoria kolónie, ktorých veľkosť a bunkové zloženie sa nelíšia od zodpovedajúcich parametrov kultivačného rastu kmeňových buniek kostnej drene. Zároveň sa pri retransplantácii buniek tvoriacich kolónie zo žĺtkového vaku s vysokým proliferačným potenciálom vytvorí výrazne viac dcérskych buniek tvoriacich kolónie a multipotentných progenitorových buniek ako pri použití progenitorových buniek hematopoézy kostnej drene.

Konečný záver o úlohe hematopoetických kmeňových buniek žĺtkového vaku v definitívnej hematopoéze by mohli poskytnúť výsledky práce, v ktorej autori získali líniu endotelových buniek žĺtkového vaku (G166), ktorá účinne podporovala proliferáciu svojich buniek s fenotypovými a funkčnými charakteristikami HSC (AA4.1+WGA+, nízka hustota a slabé adhezívne vlastnosti). Obsah týchto buniek sa pri kultivácii na podkladovej vrstve buniek C166 počas 8 dní zvýšil viac ako 100-násobne. V zmiešaných kolóniách pestovaných na podvrstve buniek C166 boli identifikované makrofágy, granulocyty, megakaryocyty, blastové bunky a monocyty, ako aj prekurzorové bunky B- a T-lymfocytov. Bunky žĺtkového vaku rastúce na podvrstve endotelových buniek mali schopnosť samoreprodukcie a v experimentoch autorov vydržali až tri pasáže. Obnovenie hematopoézy s ich pomocou u dospelých myší s ťažkou kombinovanou imunodeficienciou (SCID) bolo sprevádzané tvorbou všetkých typov leukocytov, ako aj T- a B-lymfocytov. Autori však vo svojich štúdiách použili bunky žĺtkového vaku 10-dňového embrya, v ktorom sú extra- a intraembryonálne cievne systémy už uzavreté, čo nám neumožňuje vylúčiť prítomnosť intraembryonálnych HSC medzi bunkami žĺtkového vaku.

Zároveň analýza diferenciačného potenciálu hematopoetických buniek v raných štádiách vývoja, izolovaných pred zjednotením cievnych systémov žĺtkového vaku a embrya (8-8,5 dňa tehotenstva), odhalila prítomnosť prekurzorov T- a B-buniek v žĺtkovom vaku, ale nie v tele embrya. V systéme in vitro sa metódou dvojstupňovej kultivácie na monovrstve epitelových a subepitelických buniek týmusu mononukleárne bunky žĺtkového vaku diferencovali na pre-T- a zrelé T-lymfocyty. Za rovnakých kultivačných podmienok, ale na monovrstve stromálnych buniek pečene a kostnej drene, sa mononukleárne bunky žĺtkového vaku diferencovali na pre-B-bunky a zrelé IglVT-B-lymfocyty.

Výsledky týchto štúdií naznačujú možnosť vývoja buniek imunitného systému z extraembryonálneho tkaniva žĺtkového vaku a tvorba primárnych T- a B-bunkových línií závisí od faktorov stromálneho mikroprostredia embryonálnych hematopoetických orgánov.

Iní autori tiež preukázali, že žĺtkový vak obsahuje bunky s potenciálom pre lymfoidnú diferenciáciu a výsledné lymfocyty sa nelíšia v antigénnych charakteristikách od buniek pohlavne dospelých zvierat. Bolo zistené, že bunky žĺtkového vaku 8-9 dní starého embrya sú schopné obnoviť lymfopoézu v atymocytovom týmuse so vznikom zrelých CD3+CD4+- a CD3+CD8+-lymfocytov s vytvoreným repertoárom T-bunkových receptorov. Týmus teda môže byť osídlený bunkami extraembryonálneho pôvodu, ale nie je možné vylúčiť pravdepodobnú migráciu skorých prekurzorových buniek T-lymfocytov z intraembryonálnych zdrojov lymfopoézy do týmusu.

Zároveň transplantácia hematopoetických buniek zo žĺtkového vaku dospelým ožiareným príjemcom nie vždy vedie k dlhodobej repopulácii depleovaných lokalizačných zón hematopoetického tkaniva a bunky žĺtkového vaku in vitro tvoria výrazne menej slezinných kolónií ako bunky oblasti AGM. V niektorých prípadoch je s použitím buniek žĺtkového vaku 9-dňového embrya stále možné dosiahnuť dlhodobú (až 6 mesiacov) repopuláciu hematopoetického tkaniva u ožiarených príjemcov. Autori sa domnievajú, že bunky žĺtkového vaku s fenotypom CD34+c-kit+ sa nielenže nelíšia od buniek z oblasti AGM v schopnosti repopulovať depleované hematopoetické orgány, ale aj účinnejšie obnovujú hematopoézu, keďže žĺtkový vak ich obsahuje takmer 37-krát viac.

Treba poznamenať, že v experimentoch sa použili hematopoetické bunky zo žĺtkového vaku s markerovými antigénmi hematopoetických kmeňových buniek (c-kit+ a/alebo CD34+ a CD38+), ktoré boli injekčne podané priamo do pečene alebo brušnej žily potomstva samíc myší, ktoré dostali injekciu busulfánu v 18. deň tehotenstva. U takýchto novonarodených zvierat bola ich vlastná myelopoéza prudko potlačená v dôsledku eliminácie hematopoetických kmeňových buniek spôsobenej busulfánom. Po transplantácii hematopoetických kmeňových buniek zo žĺtkového vaku boli v periférnej krvi príjemcov počas 11 mesiacov detegované vytvorené elementy obsahujúce donorový marker - glycerofosfátdehydrogenázu. Zistilo sa, že HSC zo žĺtkového vaku obnovujú obsah lymfoidných, myeloidných a erytroidných buniek v krvi, týmuse, slezine a kostnej dreni a úroveň chimerizmu bola vyššia v prípade intrahepatálneho ako intravenózneho podania buniek zo žĺtkového vaku. Autori sa domnievajú, že HSC žĺtkového vaku embryí v ranom štádiu (do 10 dní) vyžadujú predbežnú interakciu s hematopoetickým mikroprostredím pečene, aby sa úspešne osídlili hematopoetické orgány dospelých príjemcov. Je možné, že v embryogenéze existuje jedinečné štádium vývoja, keď bunky žĺtkového vaku, spočiatku migrujúce do pečene, potom získajú schopnosť osídliť strómu hematopoetických orgánov zrelých príjemcov.

V tejto súvislosti treba poznamenať, že chimerizmus buniek imunitného systému sa pomerne často pozoruje po transplantácii buniek kostnej drene ožiareným zrelým príjemcom - v krvi týchto príjemcov sa bunky darcovského fenotypu nachádzajú v pomerne veľkom množstve medzi B-, T-lymfocytmi a granulocytmi príjemcu, čo trvá najmenej 6 mesiacov.

Hematopoetické bunky u cicavcov sa prvýkrát detegujú morfologickými metódami na 7. deň embryonálneho vývoja a sú reprezentované hematopoetickými ostrovčekmi vo vnútri ciev žĺtkového vaku. Prirodzená hematopoetická diferenciácia v žĺtkovom vaku je však obmedzená na primárne erytrocyty, ktoré si zachovávajú jadrá a syntetizujú fetálny hemoglobín. Napriek tomu sa tradične verilo, že žĺtkový vak slúži ako jediný zdroj HSC migrujúcich do hematopoetických orgánov vyvíjajúceho sa embrya a zabezpečujúcich definitívnu hematopoézu u dospelých zvierat, pretože výskyt HSC v tele embrya sa zhoduje s uzavretím cievnych systémov žĺtkového vaku a embrya. Tento názor podporujú údaje, že bunky žĺtkového vaku po klonovaní in vitro dávajú vznik granulocytom a makrofágom a in vivo slezinným kolóniám. Následne sa v priebehu transplantačných experimentov zistilo, že hematopoetické bunky žĺtkového vaku, ktoré sú v samotnom žĺtkovom vaku schopné diferenciácie iba na primárne erytrocyty, v mikroprostredí pečene novonarodených a dospelých myší SCID, depletovaného týmusu alebo stromálneho kŕmidla, získavajú schopnosť repopulovať hematopoetické orgány s obnovou všetkých hematopoetických línií aj u dospelých recipientných zvierat. V zásade nám to umožňuje klasifikovať ich ako skutočné HSC - ako bunky, ktoré fungujú v postnatálnom období. Predpokladá sa, že žĺtkový vak spolu s oblasťou AGM slúži ako zdroj HSC pre definitívnu hematopoézu u cicavcov, ale ich príspevok k vývoju hematopoetického systému je stále nejasný. Biologický význam existencie dvoch hematopoetických orgánov s podobnými funkciami v ranej embryogenéze cicavcov je tiež nejasný.

Hľadanie odpovedí na tieto otázky pokračuje. In vivo sa podarilo dokázať prítomnosť buniek, ktoré obnovujú lymfopoézu, v žĺtkovom vaku 8-8,5 dní starých embryí u subletálne ožiarených myší SCID s výrazným deficitom T- a B-lymfocytov. Hematopoetické bunky zo žĺtkového vaku boli injekčne podané intraperitoneálne aj priamo do tkaniva sleziny a pečene. Po 16 týždňoch boli u príjemcov detegované TCR/CD34 CD4+ a CD8+ T-lymfocyty a B-220+IgM+ B-lymfocyty označené antragénmi MHC darcu. Zároveň autori nenašli v tele 8-8,5 dní starých embryí kmeňové bunky schopné takejto obnovy imunitného systému.

Hematopoetické bunky žĺtkového vaku majú vysoký proliferačný potenciál a sú schopné dlhodobej autoreprodukcie in vitro. Niektorí autori identifikujú tieto bunky ako HSC na základe predĺženej (takmer 7 mesiacov) generácie erytroidných progenitorových buniek, ktoré sa od progenitorov kostnej drene erytroidnej línie líšia dlhším obdobím pasážovania, väčšou veľkosťou kolónií, zvýšenou citlivosťou na rastové faktory a dlhšou proliferáciou. Okrem toho sa za vhodných podmienok kultivácie buniek žĺtkového vaku in vitro tvoria aj lymfoidné progenitorové bunky.

Prezentované údaje nám vo všeobecnosti umožňujú považovať žĺtkový vak za zdroj HSC, menej viazaných, a preto majúcich väčší proliferačný potenciál ako kmeňové bunky kostnej drene. Napriek tomu, že žĺtkový vak obsahuje pluripotentné hematopoetické progenitorové bunky, ktoré si in vitro dlhodobo udržiavajú rôzne línie hematopoetickej diferenciácie, jediným kritériom pre úplnosť HSC je ich schopnosť dlhodobo repopulovať hematopoetické orgány príjemcu, ktorého hematopoetické bunky sú zničené alebo geneticky defektné. Kľúčovou otázkou teda je, či pluripotentné hematopoetické bunky žĺtkového vaku môžu migrovať a osídľovať hematopoetické orgány a či je vhodné revidovať známe práce, ktoré preukazujú ich schopnosť repopulovať hematopoetické orgány dospelých zvierat s tvorbou hlavných hematopoetických línií. Intraembryonálne zdroje definitívnych GSC boli identifikované u vtáčích embryí už v 70. rokoch 20. storočia, čo už vtedy spochybnilo zaužívané predstavy o extraembryonálnom pôvode GSC, a to aj u zástupcov iných tried stavovcov. V posledných rokoch sa objavili publikácie o prítomnosti podobných intraembryonálnych oblastí obsahujúcich GSC u cicavcov a ľudí.

Treba ešte raz poznamenať, že základné poznatky v tejto oblasti sú mimoriadne dôležité pre praktickú transplantáciu buniek, pretože pomôžu nielen určiť preferovaný zdroj HSC, ale aj stanoviť charakteristiky interakcie primárnych hematopoetických buniek s geneticky cudzím organizmom. Je známe, že zavedenie hematopoetických kmeňových buniek z pečene ľudského plodu do embrya ovce v štádiu organogenézy vedie k narodeniu chimérnych zvierat, v krvi a kostnej dreni ktorých je stabilne stanovených 3 až 5 % ľudských hematopoetických buniek. Zároveň ľudské HSC nemenia svoj karyotyp, zachovávajú si vysokú mieru proliferácie a schopnosť diferenciácie. Okrem toho transplantované xenogénne HSC nekonfliktujú s imunitným systémom a fagocytmi hostiteľského organizmu a netransformujú sa na nádorové bunky, čo tvorilo základ pre intenzívny vývoj metód intrauterinnej korekcie dedičnej genetickej patológie pomocou HSC alebo ESC transfekovaných deficitnými génmi.

Ale v ktorom štádiu embryogenézy je vhodnejšie vykonať takúto korekciu? Po prvýkrát sa bunky určené na hematopoézu objavujú u cicavcov bezprostredne po implantácii (6. deň tehotenstva), keď ešte chýbajú morfologické znaky hematopoetickej diferenciácie a predpokladané hematopoetické orgány. V tomto štádiu sú dispergované bunky myšieho embrya schopné repopulovať hematopoetické orgány ožiarených príjemcov s tvorbou erytrocytov a lymfocytov, ktoré sa od hostiteľských buniek líšia typom hemoglobínu, respektíve glycerofosfátizomerázy, ako aj ďalším chromozomálnym markerom (Tb) darcovských buniek. U cicavcov, rovnako ako u vtákov, súčasne so žĺtkovým vakom, pred uzavretím spoločného cievneho riečiska, sa hematopoetické bunky objavujú priamo v tele embrya v paraaortálnej splanchnopleure. Hematopoetické bunky fenotypu AA4.1+ boli izolované z oblasti AGM a charakterizované ako multipotentné hematopoetické bunky, ktoré tvoria T- a B-lymfocyty, granulocyty, megakaryocyty a makrofágy. Fenotypicky sú tieto multipotentné progenitorové bunky veľmi blízke HSC kostnej drene dospelých zvierat (CD34+c-kit+). Počet multipotentných AA4.1+ buniek medzi všetkými bunkami oblasti AGM je malý - tvoria nie viac ako 1/12 jej časti.

V ľudskom embryu bola tiež identifikovaná intraembryonálna oblasť obsahujúca HSC homológne s oblasťou AGM zvierat. Navyše, u ľudí sa viac ako 80 % multipotentných buniek s vysokým proliferačným potenciálom nachádza v tele embrya, hoci takéto bunky sú prítomné aj v žĺtkovom vaku. Podrobná analýza ich lokalizácie ukázala, že stovky takýchto buniek sú zhromaždené v kompaktných skupinách, ktoré sa nachádzajú v tesnej blízkosti endotelu ventrálnej steny dorzálnej aorty. Fenotypicky ide o bunky CD34CD45+Lin. Naopak, v žĺtkovom vaku, ako aj v iných hematopoetických orgánoch embrya (pečeň, kostná dreň), sú takéto bunky jednotlivé.

V dôsledku toho v ľudskom embryu oblasť AGM obsahuje zhluky hematopoetických buniek úzko asociovaných s ventrálnym endotelom dorzálnej aorty. Tento kontakt je možné sledovať aj na imunochemickej úrovni - bunky hematopoetických zhlukov aj endotelové bunky exprimujú vaskulárny endotelový rastový faktor, ligand Flt-3, ich receptory FLK-1 a STK-1, ako aj transkripčný faktor leukemických kmeňových buniek. V oblasti AGM sú mezenchymálne deriváty reprezentované hustým reťazcom zaoblených buniek umiestnených pozdĺž celej dorzálnej aorty a exprimujúcich tenascin C - glykoproteín základnej látky, ktorý sa aktívne podieľa na procesoch medzibunkovej interakcie a migrácie.

Multipotentné kmeňové bunky oblasti AGM po transplantácii rýchlo obnovujú hematopoézu u dospelých ožiarených myší a zabezpečujú účinnú hematopoézu po dlhú dobu (až 8 mesiacov). Autori nenašli bunky s takýmito vlastnosťami v žĺtkovom vaku. Výsledky tejto štúdie potvrdzujú údaje z inej práce, ktorá ukázala, že u embryí v skorých štádiách vývoja (10,5 dňa) je oblasť AGM jediným zdrojom buniek, ktoré zodpovedajú definícii HSC, obnovujúc myeloidnú a lymfoidnú hematopoézu u dospelých ožiarených príjemcov.

Z oblasti AGM bola izolovaná stromálna línia AGM-S3, ktorej bunky podporujú v kultúre tvorbu progenitorových buniek CFU-GM, BFU-E, CFU-E a jednotiek tvoriacich kolónie zmiešaného typu. Obsah týchto buniek sa počas kultivácie na podvrstve buniek línie AGM-S3 zvyšuje 10 až 80-krát. Mikroprostredie oblasti AGM teda obsahuje bázové bunky stromálnej línie, ktoré účinne podporujú hematopoézu, takže samotná oblasť AGM môže pôsobiť ako embryonálny hematopoetický orgán - zdroj definitívnych HSC, teda HSC, ktoré tvoria hematopoetické tkanivo dospelého zvieraťa.

Rozšírená imunofenotypizácia bunkového zloženia oblasti AGM ukázala, že obsahuje nielen multipotentné hematopoetické bunky, ale aj bunky zamerané na myeloidnú a lymfoidnú diferenciáciu (T- a B-lymfocyty). Molekulárna analýza jednotlivých buniek CD34+c-kit+ z oblasti AGM pomocou polymerázovej reťazovej reakcie však odhalila aktiváciu iba génov beta-globínu a myeloperoxidázy, ale nie lymfoidných génov kódujúcich syntézu CD34, Thy-1 a 15. Čiastočná aktivácia génov špecifických pre danú líniu je charakteristická pre skoré ontogenetické štádiá tvorby HSC a progenitorových buniek. Vzhľadom na to, že počet zaviazaných progenitorových buniek v oblasti AGM 10-dňového embrya je o 2 až 3 rády nižší ako v pečeni, možno tvrdiť, že na 10. deň embryogenézy sa hematopoéza v oblasti AGM ešte len začína, zatiaľ čo v hlavnom hematopoetickom orgáne plodu sa v tomto období hematopoetické línie už vyvinuli.

Na rozdiel od skorších (9-11 dní) hematopoetických kmeňových buniek žĺtkového vaku a oblasti AGM, ktoré znovu osídľujú hematopoetické mikroprostredie novorodenca, ale nie dospelého organizmu, hematopoetické progenitorové bunky 12-17-dňovej embryonálnej pečene už nevyžadujú skoré postnatálne mikroprostredie a osídľujú hematopoetické orgány dospelého zvieraťa o nič horšie ako novorodenec. Po transplantácii embryonálnych pečeňových HSC mala hematopoéza u ožiarených dospelých recipientných myší polyklonálny charakter. Okrem toho sa pomocou značených kolónií ukázalo, že fungovanie vštepených klonov je úplne podriadené klonálnej sukcesii zistenej v dospelej kostnej dreni. V dôsledku toho embryonálne pečeňové HSC, značené za najšetrnejších podmienok, bez predstimulácie exogénnymi cytokínmi, už majú hlavné atribúty dospelých HSC: nevyžadujú skoré postembryonálne mikroprostredie, po transplantácii vstupujú do stavu hlbokého dormantného spánku a postupne sa mobilizujú do klonálnej formácie v súlade s modelom klonálnej sukcesie.

Je zrejmé, že je potrebné sa podrobnejšie venovať fenoménu klonálnej sukcesie. Erytropoézu vykonávajú hematopoetické kmeňové bunky, ktoré majú vysoký proliferačný potenciál a schopnosť diferencovať sa na všetky línie prekurzorových buniek krviniek. Pri normálnej intenzite hematopoézy je väčšina hematopoetických kmeňových buniek v dormantnom stave a je mobilizovaná na proliferáciu a diferenciáciu, pričom postupne vytvára klony, ktoré sa navzájom nahrádzajú. Tento proces sa nazýva klonálna sukcesia. Experimentálne dôkazy o klonálnej sukcesii v hematopoetickom systéme boli získané v štúdiách s HSC označenými retrovírusovým prenosom génov. U dospelých zvierat je hematopoéza udržiavaná mnohými súčasne fungujúcimi hematopoetickými klonmi, derivátmi HSC. Na základe fenoménu klonálnej sukcesie bol vyvinutý repopulačný prístup k identifikácii HSC. Podľa tejto zásady sa rozlišuje medzi dlhodobými hematopoetickými kmeňovými bunkami (LT-HSC), ktoré sú schopné obnovovať hematopoetický systém počas celého života, a krátkodobými HSC, ktoré túto funkciu vykonávajú po obmedzený čas.

Ak berieme do úvahy hematopoetické kmeňové bunky z hľadiska repopulačného prístupu, potom zvláštnosťou hematopoetických buniek embryonálnej pečene je ich schopnosť vytvárať kolónie, ktoré sú výrazne väčšie ako kolónie v rastových bunkách HSC z pupočníkovej krvi alebo kostnej drene, a to platí pre všetky typy kolónií. Už len táto skutočnosť naznačuje vyšší proliferačný potenciál hematopoetických buniek embryonálnej pečene. Jedinečnou vlastnosťou hematopoetických progenitorových buniek embryonálnej pečene je kratší bunkový cyklus v porovnaní s inými zdrojmi, čo má veľký význam z hľadiska účinnosti repopulácie hematopoetických orgánov počas transplantácie. Analýza bunkového zloženia hematopoetickej suspenzie získanej zo zdrojov zrelého organizmu naznačuje, že vo všetkých štádiách ontogenézy sú jadrové bunky prevažne reprezentované definitívne diferencovanými bunkami, ktorých počet a fenotyp závisia od ontogenetického veku darcu hematopoetického tkaniva. Najmä suspenzie mononukleárnych buniek kostnej drene a pupočníkovej krvi pozostávajú z viac ako 50 % zrelých buniek lymfoidného radu, zatiaľ čo hematopoetické tkanivo embryonálnej pečene obsahuje menej ako 10 % lymfocytov. Okrem toho sú bunky myeloidnej línie v embryonálnej a fetálnej pečeni zastúpené prevažne erytroidným radom, zatiaľ čo v pupočníkovej krvi a kostnej dreni prevládajú granulocytovo-makrofágové prvky.

Je tiež dôležité, že embryonálna pečeň obsahuje kompletnú sadu najskorších hematopoetických prekurzorov. Medzi nimi treba spomenúť erytroidné, granulopoetické, megakaryopoetické a multilíniové kolónie tvoriace bunky. Ich primitívnejšie prekurzory - LTC-IC - sú schopné proliferovať a diferencovať sa in vitro počas 5 týždňov alebo dlhšie a zachovávajú si funkčnú aktivitu aj po uhryznutí do tela príjemcu počas alogénnej a dokonca xenogénnej transplantácie imunodeficientným zvieratám.

Biologická účelnosť prevahy erytroidných buniek v embryonálnej pečeni (až 90 % z celkového počtu hematopoetických prvkov) je spôsobená potrebou zabezpečiť rýchlo rastúci objem krvi vyvíjajúceho sa plodu erytrocytovou hmotou. V embryonálnej pečeni je erytropoéza reprezentovaná jadrovými erytroidnými prekurzormi rôzneho stupňa zrelosti obsahujúcimi fetálny hemoglobín (a2u7), ktorý vďaka svojej vyššej afinite ku kyslíku zabezpečuje jeho účinnú absorpciu z materskej krvi. Zintenzívnenie erytropoézy v embryonálnej pečeni je spojené s lokálnym zvýšením syntézy erytropoetínu (EPO). Je pozoruhodné, že samotná prítomnosť erytropoetínu je postačujúca na realizáciu hematopoetického potenciálu hematopoetických buniek v embryonálnej pečeni, zatiaľ čo na naviazanie HSC kostnej drene a pupočníkovej krvi na erytropoézu je potrebná kombinácia cytokínov a rastových faktorov pozostávajúcich z EPO, SCF, GM-CSF a IL-3. Zároveň skoré hematopoetické progenitorové bunky izolované z embryonálnej pečene, ktoré nemajú receptory pre EPO, nereagujú na exogénny erytropoetín. Pre indukciu erytropoézy v suspenzii mononukleárnych buniek embryonálnej pečene je nevyhnutná prítomnosť pokročilejších buniek citlivých na erytropoetín s fenotypom CD34+CD38+, ktoré exprimujú EPO receptor.

V literatúre stále neexistuje konsenzus o vývoji hematopoézy v embryonálnom období. Funkčný význam existencie extra- a intraembryonálnych zdrojov hematopoetických progenitorových buniek nebol stanovený. Niet však pochýb o tom, že v ľudskej embryogenéze je pečeň ústredným orgánom hematopoézy a v 6. až 12. týždni tehotenstva slúži ako hlavný zdroj hematopoetických kmeňových buniek, ktoré osídľujú slezinu, týmus a kostnú dreň. GDR zabezpečujú vykonávanie zodpovedajúcich funkcií v pre- a postnatálnom období vývoja.

Treba ešte raz poznamenať, že embryonálna pečeň sa v porovnaní s inými zdrojmi vyznačuje najvyšším obsahom HSC. Približne 30 % buniek CD344 embryonálnej pečene má fenotyp CD38. Zároveň počet lymfoidných progenitorových buniek (CD45+) v skorých štádiách hematopoézy v pečeni nepresahuje 4 %. Bolo zistené, že s vývojom plodu od 7. do 17. týždňa tehotenstva sa počet B-lymfocytov progresívne zvyšuje s mesačným „krokom“ 1,1 %, zatiaľ čo hladina HSC trvalo klesá.

Funkčná aktivita hematopoetických kmeňových buniek závisí aj od obdobia embryonálneho vývoja ich zdroja. Štúdia aktivity tvorby kolónií pečeňových buniek ľudských embryí v 6. – 8. a 9. – 12. týždni tehotenstva počas kultivácie v polotekutom médiu v prítomnosti SCF, GM-CSF, IL-3, IL-6 a EPO ukázala, že celkový počet kolónií je 1,5-krát vyšší pri nasiatí HSC embryonálnej pečene v skorých štádiách vývoja. Zároveň je počet myelopoetických progenitorových buniek, ako je CFU-GEMM, v pečeni v 6. – 8. týždni embryogenézy viac ako trikrát vyšší ako ich počet v 9. – 12. týždni tehotenstva. Vo všeobecnosti bola aktivita tvorby kolónií hematopoetických pečeňových buniek embryí v prvom trimestri tehotenstva významne vyššia ako aktivita fetálnych pečeňových buniek v druhom trimestri tehotenstva.

Vyššie uvedené údaje naznačujú, že embryonálna pečeň sa na začiatku embryogenézy vyznačuje nielen zvýšeným obsahom skorých hematopoetických progenitorových buniek, ale jej hematopoetické bunky sa vyznačujú širším spektrom diferenciácie do rôznych bunkových línií. Tieto znaky funkčnej aktivity hematopoetických kmeňových buniek embryonálnej pečene môžu mať určitý klinický význam, pretože ich kvalitatívne charakteristiky nám umožňujú očakávať výrazný terapeutický účinok pri transplantácii aj malého počtu buniek získaných v skorých štádiách tehotenstva.

Napriek tomu zostáva problém množstva hematopoetických kmeňových buniek potrebných na účinnú transplantáciu otvorený a relevantný. Vynakladajú sa pokusy na jeho riešenie s využitím vysokého potenciálu samoreprodukcie hematopoetických buniek embryonálnej pečene in vitro pri stimulácii cytokínmi a rastovými faktormi. Pri konštantnej perfúzii skorých embryonálnych pečeňových HSC v bioreaktore je možné po 2-3 dňoch získať množstvo hematopoetických kmeňových buniek s výstupom, ktorý je 15-krát vyšší ako ich počiatočná úroveň. Pre porovnanie treba poznamenať, že na dosiahnutie 20-násobného zvýšenia výstupu ľudských HSC z pupočníkovej krvi za rovnakých podmienok sú potrebné najmenej dva týždne.

Embryonálna pečeň sa teda líši od iných zdrojov hematopoetických kmeňových buniek vyšším obsahom viazaných aj skorých hematopoetických progenitorových buniek. V kultúre s rastovými faktormi tvoria embryonálne pečeňové bunky s fenotypom CD34+CD45Ra1 CD71l0W 30-krát viac kolónií ako podobné bunky z pupočníkovej krvi a 90-krát viac ako HSC kostnej drene. Najvýraznejšie rozdiely v uvedených zdrojoch sú v obsahu skorých hematopoetických progenitorových buniek, ktoré tvoria zmiešané kolónie - množstvo CFU-GEMM v embryonálnej pečeni prevyšuje množstvo v pupočníkovej krvi a kostnej dreni 60-krát, respektíve 250-krát.

Je tiež dôležité, že až do 18. týždňa embryonálneho vývoja (obdobie nástupu hematopoézy v kostnej dreni) sa na realizácii hematopoetickej funkcie podieľa viac ako 60 % pečeňových buniek. Keďže ľudský plod nemá týmus a teda ani tymocyty až do 13. týždňa vývoja, transplantácia hematopoetických buniek z embryonálnej pečene v 6. – 12. týždni tehotenstva významne znižuje riziko vzniku reakcie „štep verzus hostiteľ“ a nevyžaduje výber histokompatibilného darcu, pretože umožňuje relatívne jednoduché dosiahnutie hematopoetického chimerizmu.