Diagnostika mitochondriálnych ochorení

Hodnotenie povahy dedičnosti a prejavov klinických príznakov mitochondriálnych ochorení

Keďže myotochondriálne ochorenia môžu byť v niektorých prípadoch spôsobené poškodením jadrového genómu, prenos ochorenia bude zodpovedať Mendelovým zákonom dedičnosti. V prípadoch, keď je vývoj ochorenia spôsobený mutáciami v mitochondriálnej DNA, bude dedičnosť zodpovedať mitochondriálnemu typu, to znamená, že sa bude prenášať po materskej línii. Nakoniec, keď sa patológia vyvinie so súčasným poškodením génov jadrového a mitochondriálneho genómu, bude dedičnosť komplexná a určená rôznymi faktormi. V tomto ohľade je možné pri genealogickej analýze podľa formálneho znaku (povaha dedičnosti podľa rodokmeňa) uviesť najrôznejšie typy dedičnosti: autozomálne dominantnú, autozomálne recesívnu, X-viazanú, mitochondriálnu.

Vývoj myotochondriálnych ochorení, ako je porucha metabolizmu kyseliny pyrohroznovej alebo beta-oxidácia mastných kyselín, Krebsov cyklus, je spojený s mutáciami génov jadrového genómu. Tieto patológie sú charakterizované autozomálne recesívnou dedičnosťou, keď sú rodičia nositeľmi mutácií (heterozygoti) a dieťa je nositeľom oboch zdedených mutácií od otca aj matky (homozygot). Rodičia sú zvyčajne navonok zdraví a podobné ochorenie alebo jeho mikropríznaky by sa mali hľadať u bratov a sestier chorého dieťaťa (proband sibs) a u príbuzných z matkinej aj otcovej strany (bratranci a sesternice).

V prípade recesívneho, na X viazaného typu dedičnosti (napr. neonatálna glutárová acidúria typu II alebo deficit podjednotky E1 pyruvového komplexu, Menkesova choroba atď.) sú častejšie postihnutí chlapci a matky sú nositeľkami mutácií a prenášajú ich na svojich synov. Materská dedičnosť sa od dedičnosti viazanej na X líši tým, že sú postihnuté obe pohlavia. V týchto prípadoch je pri analýze rodokmeňa potrebné analyzovať výskyt ochorenia u mužov, pretože u žien sa neprejaví. Rodokmeň nepreukazuje prenos ochorenia po línii otec-syn, keďže otec môže na syna preniesť iba chromozóm Y.

Keď sa ochorenie vyvinie v dôsledku poškodenia mitochondriálneho genómu (napríklad množstvo ochorení dýchacieho reťazca, Leberova optická neuropatia, syndrómy MELAS, MERF, NARP atď.), sleduje sa materská dedičnosť, pretože dieťa zdedí mitochondrie od matky a tá ich môže preniesť na chlapcov aj dievčatá. Obe pohlavia sú teda postihnuté rovnako. V tomto ohľade by sa mal v rodokmeni sledovať prenos ochorenia po matkinej línii.

Pri analýze rodokmeňa a hľadaní príznakov mitochondriálnych ochorení u príbuzných treba mať na pamäti, že závažnosť ochorenia (expresivita znaku) sa môže značne líšiť, čo môže byť spôsobené rôznym počtom poškodených mitochondrií, povahou ich poškodenia, rôznym rozložením mutácií v bunkách atď. Preto nie je vždy možné odhaliť zjavné príznaky ochorení. V niektorých prípadoch sa zisťujú buď jednotlivé, vymazané príznaky, alebo príznaky, ktoré je možné zistiť počas ich cieleného vyhľadávania.

Vývoj mitochondriálnej patológie môže byť spojený s poškodením rozsiahlych oblastí mitochondrií, tzv. mikrodeleciami (napríklad Kearns-Sayreov syndróm, Pearsonov syndróm, niektoré formy diabetes mellitus s hluchotou, progresívna vonkajšia oftalmoplegia atď.). V týchto prípadoch sa charakteristické príznaky u príbuzných často nevyskytujú, pretože vývoj ochorení je spojený so vznikom nových mutácií, ku ktorým došlo v zygote bezprostredne po oplodnení vajíčka ( de novo mutácia). Ochorenie je sporadické. Často sa spolu s týmito ochoreniami dedí autozomálne dominantným spôsobom množstvo stavov spojených s viacerými mutáciami mitochondriálnej DNA: napríklad niektoré formy encefalomyopatie, myopatie s poškodením očí, napriek prítomnosti mutácií mtDNA (viacnásobné delécie), majú autozomálne dominantný typ dedičnosti.

Na rozdiel od Mendelovho dedenia sa však autozomálne dominantný typ dedenia v mitochondriálnej patológii vyznačuje veľkým počtom postihnutých jedincov v nasledujúcich generáciách.

Nakoniec, niektoré mitochondriálne ochorenia, často spojené s depléciou mitochondrií mtDNA alebo ich absenciou v bunkách, sa môžu dediť autozomálne recesívne. Patria sem vrodené formy myopatie, kardiomyopatie, neurodistresového syndrómu, laktátovej acidózy, poškodenia pečene atď.

Štúdium povahy dedičného prenosu ochorenia je dôležité pre lekársku a genetickú prognózu a vyžaduje si hlbokú analýzu klinických príznakov so znalosťou mechanizmov vzniku mitochondriálnej patológie a typov jej dedičnosti.

Prejav klinických prejavov sa značne líši od prvých dní života až po dospelosť. Pri analýze tohto ukazovateľa je potrebné zohľadniť nozologické formy, pretože každá z nich má určitý vek debutu.

Metabolické poruchy pozorované pri mitochondriálnych ochoreniach sú vo veľkej väčšine prípadov progresívne. Počiatočné príznaky sú často mierne, potom progredujú a môžu viesť k významným invalidizujúcim poruchám. Zriedkavé formy patológie, ako je benígna infantilná myopatia a niektoré formy Leberovej optickej neuropatie, môžu byť benígne a podliehať regresii.

Počas laboratórnych testov sa pozornosť venuje charakteristickým znakom mitochondriálnych ochorení:

• prítomnosť acidózy;
• zvýšené hladiny laktátu a pyruvátu v krvi, zvýšenie indexu laktát/pyruvát o viac ako 15, najmä zvyšujúce sa pri záťaži glukózou alebo fyzickej aktivite;
• hyperketonémia;
• hypoglykémia;
• hyperamonémia;
• zvýšené koncentrácie acetoacetátu a 3-hydroxybutyrátu;
• zvýšený pomer kyseliny 3-hydroxymaslovej a kyseliny acetoctovej v krvi;
• zvýšené hladiny aminokyselín v krvi a moči (alanín, glutamín, kyselina glutámová, valín, leucín, izoleucín);
• zvýšené hladiny mastných kyselín v krvi;
• hyperexkrécia organických kyselín močom;
• znížené hladiny karnitínu v krvi;
• zvýšenie obsahu myoglobínu v biologických tekutinách;
• znížená aktivita mitochondriálnych enzýmov v myocytoch a fibroblastoch.

Diagnostická hodnota týchto indikátorov je vyššia pri potravinovej záťaži ako nalačno. V praxi sa osvedčil diagnostický test: stanovenie laktátu v krvi na pozadí glukózovej záťaže, čo umožňuje jasnejšiu detekciu zlyhania dýchacieho reťazca pri dodatočnej glukózovej záťaži.

Na laboratórnu diagnostiku mitochondriálnej dysfunkcie a jej špecifických nozologických foriem nestačia konvenčné, rutinné biochemické metódy výskumu, je potrebné vykonať špeciálne testy. Analýza aktivity enzýmov v biopsiách kostrového svalstva je obzvlášť výhodná ako v iných tkanivách. Je možné stanoviť aktivitu enzýmov dýchacieho reťazca, najmä citrátsyntetázy, sukcinátdehydrogenázy a cytochróm C oxidázy.

Údaje z morfologických a molekulárno-genetických štúdií

Morfologické štúdie majú mimoriadny význam v diagnostike mitochondriálnej patológie. Vzhľadom na ich veľkú výpovednú hodnotu je často potrebná biopsia svalového tkaniva a histochemické vyšetrenie získaných biopsií. Dôležité informácie možno získať súčasným vyšetrením materiálu pomocou svetelnej a elektrónovej mikroskopie.

Jedným z dôležitých markerov mitochondriálnych ochorení je fenomén „roztrhaných“ červených vlákien [fenomén RRF (ragged red fibres)], stanovený v roku 1963. Je spojený s tvorbou geneticky zmenených abnormálnych mitochondrií pozdĺž okraja svalového vlákna v dôsledku proliferácie a fokálnej akumulácie. Tento fenomén sa deteguje svetelnou mikroskopiou s použitím špeciálneho Gomoriho farbiva, ale v posledných rokoch sa na tento účel používajú rôzne mitochondriálne markery a rôzne imunologické metódy.

Medzi ďalšie morfologické príznaky mitochondriálnej patológie patria:

• prudký nárast veľkosti mitochondrií;
• akumulácia glykogénu, lipidov a vápenatých konglomerátov v subsarkoléme;
• znížená aktivita mitochondriálnych enzýmov;
• narušená distribúcia granúl aktivity enzýmov sukcinátdehydrogenáza (SDH), NADH oxidoreduktáz, cytochróm C oxidáza atď.

U pacientov s mitochondriálnymi ochoreniami môže svetelná mikroskopia svalového tkaniva odhaliť nešpecifické morfologické znaky: lokálnu nekrózu svalových vlákien, akumuláciu sarkoplazmatických hmôt, prítomnosť lýzy subsarkolemálnych oblastí sarkoplazmy, bazofíliu sarkoplazmy, zvýšený počet svalových jadier, aktiváciu regeneračných procesov atď.

Štúdia úlohy fenoménu „roztrhaných“ červených vlákien ukázala jeho význam pre diagnostiku stavov, ako sú MELAS, MERRF, Kearns-Sayreov syndróm, chronická progresívna oftalmoplegia a ďalšie spojené s mutáciami mtDNA. Tento jav sa môže vyvinúť aj pri iných ochoreniach: Duchenneova svalová dystrofia, dermatomyozitída, myotonická dystrofia, užívanie liekov (klofibrát) a iné patologické stavy. Fenomén RRF teda môže popri primárnych mitochondriálnych ochoreniach sprevádzať aj sekundárne mitochondriálne dysfunkcie.

V súčasnosti sa rozšírilo histochemické a elektrónmikroskopické vyšetrenie svalového tkaniva na detekciu príznakov mitochondriálnej insuficiencie. V niektorých prípadoch pomáhajú pri diagnostike, najmä pri normálnom morfologickom obraze svalového tkaniva podľa údajov svetelnej mikroskopie.

Elektrónovo-mikroskopické znaky - detekcia proliferácie mitochondrií, narušenie ich tvaru a veľkosti, dezorganizácia a zväčšenie kríst, akumulácia abnormálnych mitochondrií pod sarkolemou, akumulácia lipidov a abnormálnych parakryštalických (prevažne z bielkovín) alebo osmofilných inklúzií lokalizovaných medzi vnútornou a vonkajšou membránou alebo v krístach, sférické zhluky, často umiestnené v matrici (pozostávajúce prevažne z triglyceridov) atď.

U niektorých pacientov možno zistiť cytochemické abnormality v leukocytoch.

Komplex biochemických a morfologických štúdií je doplnený modernými metódami molekulárnej diagnostiky (detekcia jadrových alebo mitochondriálnych mutácií), ktoré sa vykonávajú v špecializovaných laboratóriách DNA diagnostiky. Pri mitochondriálnych ochoreniach sa zisťujú rôzne typy mutácií: bodové mutácie, delécie, duplikácie, kvantitatívne anomálie DNA atď.

Pri absencii mutácií v mtDNA, ak existuje podozrenie na mitochondriálnu patológiu, sa vykoná štúdia jadrovej DNA.

Diagnostické kritériá

Existujú 2 skupiny diagnostických kritérií pre mitochondriálne ochorenia. Hlavné diagnostické kritériá (prvá skupina).

• Klinické:
  • stanovené diagnózy: MERRF, MELAS, NARP, MNGIE, Pearsonov syndróm, Leberova neuropatia, Leighova a Alpersova choroba;
  • prítomnosť 2 alebo kombinácie nasledujúcich príznakov:
    • multisystémová lézia, patognomická pre ochorenia dýchacieho reťazca;
    • progresívny priebeh s epizódami exacerbácie alebo prítomnosťou mitochondriálnych mutácií v rodine;
    • vylúčenie metabolických a iných ochorení vykonaním vhodných testov.
• Histologické - detekcia fenoménu RRF vo viac ako 2 % svalového tkaniva.
• Enzymatické:
  • vlákna negatívne na cytochróm c oxidázu;
  • znížená aktivita enzýmov respiračného reťazca (<20 % normálu v tkanive, <30 % v bunkách alebo viacerých tkanivách).
• Funkčné - zníženie syntézy ATP vo fibroblastoch o viac ako 3 štandardné odchýlky.
• Molekulárne genetické - patogeneticky významné mutácie jadrovej alebo mtDNA.

Doplňujúce diagnostické kritériá (druhá skupina).

• Klinické - nešpecifické príznaky, ktoré sa vyskytujú pri ochoreniach dýchacieho reťazca (mŕtvo narodené dieťa, znížená motorická aktivita plodu, skoré úmrtie novorodencov, poruchy pohybu, vývojové poruchy, zhoršený svalový tonus v novorodeneckom období).
• Histologické - malé percento fenoménu RRF, subsarkolemálna akumulácia mitochondrií alebo ich anomálie.
• Enzymatická - nízka aktivita enzýmov respiračného komplexu (20-30% normy v tkanive, 30-40% v bunkách alebo bunkových líniách).
• Funkčné - zníženie syntézy ATP vo fibroblastoch o 2-3 štandardné odchýlky alebo absencia rastu fibroblastov v médiu s galaktózou.
• Molekulárna genetika - detekcia mutácií v jadrovej alebo mtDNA s predpokladanou patogenetickou väzbou.
• Metabolický - detekcia jedného alebo viacerých metabolitov, čo naznačuje poruchu bunkovej bioenergetiky.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]