Patogenéza tuberkulózy

Vývoj zápalu tuberkulózy závisí od reaktivity organizmu a stavu jeho obranyschopnosti, virulencie mykobaktérií tuberkulózy a trvania ich pretrvávania v pľúcach. Pôsobenie rôznych faktorov infekčného procesu môže vysvetliť veľkú rozmanitosť tkanivových a bunkových reakcií dýchacieho oddelenia, kde sa špecifické zmeny kombinujú s nešpecifickými, čím tak či onak ovplyvňujú prejavy a výsledok hlavného procesu.

Každé štádium predstavuje komplexný súbor štrukturálnych zmien v rôznych telesných systémoch a dýchacích orgánoch, sprevádzaných výraznými zmenami v metabolických procesoch, intenzite metabolických reakcií dýchacieho systému a odráža sa v morfofunkčnom stave jeho bunkových a nebunkových prvkov. Veľký význam má štúdium najskorších mechanizmov vývoja tuberkulózneho zápalu, ktoré bolo zistené v posledných rokoch.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Poruchy mikrocirkulácie a stav aerohematickej bariéry

Do 24 hodín po intravenóznom podaní Mycobacterium tuberculosis do pľúc myší dochádza k charakteristickým zmenám v mikrocirkulačnom riečisku: možno pozorovať rozšírenie profilov cievnej kapilárnej siete, tvorbu kalu erytrocytov s parietálnym usporiadaním polymorfonukleárnych leukocytov. Elektrónovo-mikroskopická analýza endotelovej výstelky pľúcnych kapilár odhaľuje aktiváciu luminálneho povrchu buniek, známky vývoja intracelulárneho edému s dezorganizáciou mikropinocytotických vezikúl a ich fúziou do veľkých vakuol. Oblasti edematóznej, vyčistenej cytoplazmy endotelocytov miestami tvoria plachtovité výbežky, ktoré sa v rôznych mikrocievach líšia množstvom a veľkosťou. V niektorých prípadoch sa pozoruje lokálna exfoliácia ich cytoplazmatických výbežkov z podkladovej bazálnej vrstvy, jej uvoľnenie a zhrubnutie.

Bez ohľadu na spôsob zavedenia tuberkulózneho mykobaktéria sa vo všetkých modelových experimentoch v prvých 3-5 dňoch pozoruje zvýšenie priepustnosti aerohematickej bariéry, o čom svedčí akumulácia tekutiny v intersticiu, rozvoj intracelulárneho edému nielen endoteliocytov, ale aj alveolocytov 1. typu (A1). Zmeny ovplyvňujú ich cytoplazmatické procesy, v ktorých sa objavujú oblasti čírej, edematóznej cytoplazmy, schopné vydutia do intraalveolárneho priestoru.

V miestach generalizácie mycobacterium tuberculosis a vývoja pneumonických ložísk, tvorby primárnych granulomatóznych akumulácií mononukleárnych buniek a polymorfonukleárnych leukocytov sa určuje A1 so silne zhrubnutými, miestami zničenými cytoplazmatickými výbežkami, oblasťami obnaženej bazálnej membrány. V mnohých alveolocytoch 2. typu (A2) dochádza k opuchu apikálnych mikroklkov, nerovnomernému rozšíreniu mitochondriálnych profilov a cytoplazmatického retikula. Hyperhydratácia alveolárneho epitelu je miestami sprevádzaná uvoľňovaním tekutiny, plazmatických bielkovín a bunkových prvkov zápalu do intraalveolárneho priestoru.

Moderné štúdie mikrocirkulácie preukázali vedúcu úlohu cievneho systému v rozvoji počiatočných fáz zápalu. Endotel, stimulovaný cytokínmi, vylučuje biologicky aktívne látky - adhezívne molekuly (selektíny, integríny), rôzne mediátory (metabolity kyseliny arachidónovej) a rastové faktory, kyslíkové radikály, oxid dusnatý atď., ktoré zabezpečujú interakciu medzi endotelom a polymorfonukleárnymi leukocytmi, ako aj medzi inými bunkovými prvkami zápalu. Bolo zistené, že L-selektín sprostredkováva tzv. efekt „rolujúcich sa neutrofilov“, čo je počiatočná fáza adhézie týchto buniek k endotelu. Ďalší typ selektínu, P-selektín, sa po pôsobení histamínu alebo kyslíkových metabolitov na endotelové bunky premiestňuje na ich povrch, čím uľahčuje adhéziu neutrofilov. E-selektín sa tiež deteguje na povrchu endotelových buniek aktivovaných cytokínmi; podieľa sa na procese interakcie medzi endotelom postkapilárnych venúl a T-lymfocytmi.

Cytokíny vylučované mono- a polynukleárnymi bunkami spôsobujú štrukturálnu prestavbu cytoskeletu endotelových buniek, čo vedie k ich kontrakcii a zvýšenej permeabilite kapilár. Prechod polymorfonukleárnych leukocytov cez stenu ciev môže byť následne sprevádzaný jej poškodením a zvýšenou permeabilitou pre tekutiny a plazmatické bielkoviny a zmena zloženia alebo aktivity adhezívnych molekúl vedie k zvýšenej migrácii monocytov a lymfocytov, čo zabezpečuje ďalší rozvoj zápalovej reakcie. Vzniká v dýchacích orgánoch v reakcii na zavedenie Mycobacterium tuberculosis a ovplyvňuje všetky štruktúry dýchacieho traktu.

Počas tvorby a dozrievania tuberkulóznych granulómov, teda v druhom štádiu vývoja špecifického procesu, sa zvyšujú poruchy v štruktúre interalveolárnych sept. Edém, proliferácia buniek a fibrillogenéza v intersticiu významne menia morfofunkčný stav respiračného epitelu, najmä v blízkosti ložísk zápalovej reakcie. Poruchy podmienok mikroprostredia a životne dôležitej aktivity alveolocytov negatívne ovplyvňujú funkčný stav aerohematickej bariéry a výmenu plynov v pľúcach.

Spolu s už zaznamenanými zmenami v interalveolárnych septách v edémovej zóne pútajú pozornosť výrazné deštruktívne zmeny v alveolárnom epiteli, ktoré možno sledovať na jeho významnej časti. Postihujú oba typy alveolocytov a majú jeden smer - edematózny opuch intracelulárnych organel, ktorý vedie k dysfunkcii a následnej bunkovej smrti. V intraalveolárnom obsahu možno zistiť fragmenty zničených alveolárnych buniek vrátane A2. Nachádzajú sa tu aj makrofágové prvky, polymorfonukleárne leukocyty, ako aj významný počet erytrocytov a eozinofilov, čo odráža vysokú permeabilitu kapilárnej siete. Medzi zničenými bunkami sa určujú fibrínové vlákna a ich konglomeráty.

V alveolách, ktoré zadržiavajú vzduch, možno pozorovať aj príznaky edému tkaniva a bunkových štruktúr interalveolárnych sept. Okrem toho na povrchu alveolárneho epitelu dochádza k procesom tvorby bublín, ktoré odrážajú počiatočné štádiá deštrukcie aerohematickej bariéry a „zaplavenia“ alveol. V konečnom štádiu vývoja tuberkulózneho zápalu sa pozoruje progresívny nárast dystrofických a deštruktívnych zmien v štrukturálnych zložkách koncových častí pľúc, najmä v oblastiach pľúcneho parenchýmu hraničiacich s kazeózno-nekrotickými ložiskami alebo ložiskami tuberkulóznej pneumónie. Poruchy mikrocirkulácie sú rozšírené.

Transkapilárny prechod plazmatických bielkovín krvi podporuje vstup cirkulujúcich imunitných komplexov (CIK) do intersticiálneho priestoru pľúc, čo podporuje rozvoj imunologických aj sekundárnych imunopatologických reakcií. Úloha týchto v patogenéze tuberkulózy bola preukázaná a je spôsobená intrapulmonálnym ukladaním CIK, poruchou fagocytového systému a nerovnováhou v produkcii cytokínov regulujúcich medzibunkové interakcie.

Plocha vzdušného pľúcneho parenchýmu je zmenšená na 30 % plochy rezu, jej oblasti sa striedajú s oblasťami výrazného intraalveolárneho edému, distelektázy a atelektázy, emfyzematózneho rozšírenia alveol. Napriek progresívnemu charakteru vývoja neliečeného tuberkulózneho zápalu prebiehajú v pľúcnom parenchýme bez ložísk kompenzačné a regeneračné procesy. Ako ukázali naše štúdie, v perifokálnej zóne zápalu je funkčná aktivita A2 zameraná najmä na udržanie integrity alveolárneho epitelu, obnovu populácie A1, ktorá je najcitlivejšia na pôsobenie faktorov tuberkulózneho procesu. Účasť A2 na regeneračných procesoch ako bunkového zdroja respiračného epitelu je dnes všeobecne uznávaná. Výrazné zvýšenie proliferačnej aktivity A2 v týchto zónach je indikované detekciou 6 – 10 mladých alveolocytov nachádzajúcich sa v blízkosti – „rastových púčikov“ s jednotnou dobre vyvinutou jadrovou štruktúrou, významným obsahom mitochondrií a polyribozómov v cytoplazme, malým počtom sekrečných granúl. V týchto bunkách možno niekedy pozorovať mitotické obrazce. Zároveň sú alveolocyty stredného typu, ktoré odrážajú transformáciu A2 na A1, extrémne zriedkavé. Funkcia výmeny plynov orgánu je zachovaná vďaka alveolárnej hypertrofii, tvorbe rastových bodov a transformácii A2 na A1 v odľahlých oblastiach pľúcneho parenchýmu. Pozorujú sa tu aj ultraštrukturálne znaky aktívnej sekrečnej funkcie A2.

Tieto údaje korelujú s výsledkami elektrónmikroskopického vyšetrenia alveolárneho epitelu v chirurgickom materiáli. U pacientov s hojacimi sa ložiskami tuberkulóznej infekcie sa tvoria adenomatózne štruktúry, ktoré pripomínajú alveolárne vývody. Bunky, ktoré ich vystieľajú, majú ultraštruktúru A2, pričom si zachovávajú jednotlivé sekrečné granule. Je charakteristické, že nedochádza k transformácii A2 na A1 (nezisťujú sa alveolocyty intermediárneho typu), čo neumožňuje klasifikovať tieto štruktúry ako novovytvorené alveoly, ako poznamenávajú niektorí autori.

Procesy obnovy respiračného epitelu, tvorba prechodných alveolocytov sa pozorujú iba vo vzdialenejšom pľúcnom parenchýme, kde sa určujú nodulárne výrastky alveolocytov zodpovedajúce „rastovým púčikom“. Tu sa vykonáva aj hlavná funkcia výmeny plynov v pľúcach, bunky aerohematickej bariéry majú dobre vyvinutú ultraštruktúru s veľkým počtom mikropinocytových vezikúl.

Štúdia rôznych modelov tuberkulózneho zápalu ukázala, že rozvoj špecifického zápalu v pľúcach je spojený nielen s určitými deštruktívnymi zmenami v dýchacích cestách priamo v ložiskách infekcie, ale postihuje celý pľúcny parenchým, kde sa pozorujú známky zhoršenej mikrocirkulácie. Zvýšená priepustnosť ciev interalveolárnych sept. S progresiou zápalového procesu sa zhoršujú javy edému, ktoré ovplyvňujú stav alveolocytov, najmä A1. Lumeny mnohých alveol sú čiastočne alebo úplne vyplnené tekutinou a bunkovými prvkami zápalu. Hypoxia a fibrózne zmeny v interalveolárnych septách ovplyvňujú funkciu výmeny plynov aerohematickej bariéry, vedú k rozvoju respiračného zlyhania a úmrtiu pokusných zvierat.

[ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Úloha pľúcnych makrofágov

Pľúcne makrofágy sú súčasťou mononukleárneho fagocytového systému, ktorý je spoločný pre celé telo a pochádza z pluripotentnej kmeňovej bunky kostnej drene. Počas delenia kmeňových buniek sa produkujú prekurzory monocytov - monoblasty a promonocyty. Monocyty cirkulujú v krvi a čiastočne vstupujú do intersticiálneho tkaniva pľúc, kde môžu určitý čas zostať neaktívne. V prítomnosti induktorov diferenciácie sa aktivujú, presúvajú sa na povrch respiračného a bronchiálneho epitelu, kde prechádzajú niekoľkými štádiami dozrievania a menia sa na alveolárne a bronchiálne makrofágy. Hlavná funkcia týchto buniek - absorpčná - je spojená s ich schopnosťou fagocytovať cudzí materiál. Ako jeden z faktorov prirodzenej odolnosti tela chránia tie oblasti pľúc, ktoré ako prvé prichádzajú do kontaktu s mikróbmi a abiogénnymi agensmi, t. j. udržiavajú sterilitu epitelovej výstelky pľúc po celej jej dĺžke. Väčšina cudzieho materiálu, ako aj fragmenty zničených bunkových prvkov, sú takmer úplne strávené po konjugácii fagozomálnej vakuoly makrofágu (nekrofágu, hemosiderofágu) s lyzozómami obsahujúcimi proteolytické enzýmy. Pľúcne makrofágy sa vyznačujú vysokým obsahom kyslej fosfatázy, nešpecifickej esterázy, katepsínov, fosfolipázy A2 a enzýmov Krebsovho cyklu, najmä sukcinátdehydrogenázy. Zároveň je známe, že patogény mnohých infekčných chorôb, a predovšetkým M. tuberculosis, môžu dlhodobo pretrvávať v cytoplazme alveolárnych makrofágov, pretože majú vysoko odolné bunkové steny, ktoré odolávajú pôsobeniu lyzozomálnych enzýmov. V modelových experimentoch na neliečených zvieratách možno napriek výraznej aktivácii kyslej fosfatázy a iných hydroláz pozorovať určitú proliferačnú aktivitu Mycobacterium tuberculosis a tvorbu malých kolóniovito podobných zhlukov patogénom v cytoplazme alveolárnych makrofágov.

Nízka mikrobicídna aktivita pľúcnych makrofágov je spojená s orgánovo špecifickými vlastnosťami fagocytov, pretože fungujú v prostredí s vysokým obsahom kyslíka. Energetické procesy v ich cytoplazme sú podporované najmä oxidačnou fosforyláciou lipoproteínov, s ktorých katabolizmom je spojená jedna z hlavných funkcií týchto buniek, ktoré sú súčasťou pľúcneho surfaktantu. Extrakcia energie a lokalizácia oxidačných procesov ovplyvňujú mitochondriálny systém, ktorého vývoj koreluje s funkčným stavom fagocytu. Lokalizuje sa tu aj superoxiddismutáza - antioxidačný ochranný enzým, ktorý katalyzuje dismutáciu singletového kyslíka vznikajúceho počas prechodu elektrónov pozdĺž dýchacieho reťazca. To zásadne odlišuje pľúcne makrofágy od polymorfonukleárnych leukocytov, ktoré prijímajú kyslík a bioenergiu najmä vďaka glykolýze. V druhom prípade dochádza k štiepeniu substrátu priamo v cytozole a aktivovaný kyslík a peroxid vodíka vznikajúci pomocou myeloperoxidázy predstavujú hlavný baktericídny potenciál pre pôsobenie na baktérie.

Nízku biocidnosť pľúcnych makrofágov možno považovať za akúsi cenu za adaptáciu na aeróbne podmienky fungovania. Zrejme preto bojujú proti mykobaktériám tuberkulózy spolu s polymorfonukleárnymi leukocytmi a exsudátovými monocytmi (nazývajú sa aj zápalové makrofágy). Patogeneticky dôležité je, že nie všetky pľúcne makrofágy, ktoré zachytili mykobaktérie tuberkulózy, sú z pľúc odstránené s driftom povrchovo aktívnej látky a bronchiálneho sekrétu - niektoré z nich sa vyvíjajú v intersticiu, čo je spúšťačom pre tvorbu charakteristických bunkových zhlukov - granulómov.

Po vstupe do intersticiálneho priestoru bohatého na cievy začnú pľúcne makrofágy s neúplnou fagocytózou produkovať zápalové cytokíny, ktoré aktivujú susedný endotel. Na jeho membránach sa zvyšuje expresia imunoglobulínov, pomocou ktorých dochádza k selektívnej adhézii monocytov. Po opustení cievneho riečiska sa tieto bunky transformujú na exsudátové makrofágy, ktoré produkujú zápalové mediátory a priťahujú do ohniska nielen mono-, ale aj polynukleárne bunky.

Zároveň signál pre rozvoj granulomatóznej reakcie pochádza zo senzibilizovaných T-lymfocytov – efektorov oneskorenej hypersenzitivity. Medzi lymfokínmi, ktoré tieto bunky začínajú produkovať, má pre granulomatogenézu veľký význam faktor inhibujúci migráciu monocytov a IL-2. Urýchľujú prítok a fixujú monocyty v mieste infekcie, regulujú ich transformáciu na fagocytujúce, sekretujúce a antigén prezentujúce makrofágy.

Treba zdôrazniť, že granulomatózna reakcia pľúc pri tuberkulóznom zápale, ktorá je mechanizmom bunkovej ochrany dýchacích orgánov pred prenikaním patogénu, v konečnom dôsledku odráža zlyhanie mononukleárnych fagocytov v boji proti tuberkulóznym mykobaktériám. Makrofágy sú preto nútené neustále proliferovať (zvyšovať počet populácií) a diferencovať sa na väčšie fagocyty (zvyšovať kvalitu proteolýzy), čo sú obrovské bunky typu cudzieho telesa. Vo fagozómoch týchto fagocytov možno pod elektrónovým mikroskopom vidieť nielen tuberkulózne mykobaktérie, ale aj veľké apoptotické bunky, fragmenty zničených polymorfonukleárnych leukocytov. Zároveň sa ultraštrukturálne znaky proteolytickej aktivity (stupeň vývoja lyzozomálneho aparátu) v takýchto fagocytoch na jednotku plochy cytoplazmy významne nelíšia od mononukleárnych. V tomto ohľade pľúcne makrofágy neustále priťahujú k lézii polymorfonukleárne leukocyty, ktoré majú väčšie biocídne vlastnosti. Aktivácia posledného menovaného je sprevádzaná uvoľňovaním významného množstva hydroláz a oxidantov do extracelulárneho prostredia, čo vedie k rozpadu tkaniva a tvorbe kazeóznych hmôt v strede lézie.

Najvýraznejšie metabolické poruchy sa pozorujú u pacientov s akútne progresívnymi formami pľúcnej tuberkulózy, ktoré sa vyskytujú s prevahou exsudatívnej a alteratívnej zápalovej reakcie, a priebeh progresívnych foriem pľúcnej tuberkulózy sa spravidla vyznačuje výraznou imunosupresiou T-buniek. Potlačenie imunity T-buniek, výrazná lymfopénia vedú k narušeniu medzibunkových interakcií a inhibícii granulomatóznej reakcie.

Nedostatok aktivovaných monocytov a lymfocytov v kombinácii s ich morfofunkčnou insuficienciou môže byť dôsledkom zvýšenej apoptózy. Cytokínová nerovnováha, ktorá sa v takýchto prípadoch vyskytuje, môže slúžiť ako marker poruchy imunitného systému. Proces apoptózy má charakteristické morfologické znaky: kondenzáciu chromatínu na jadrovej membráne, rozpad jadierka, tvorbu bunkových fragmentov (apoptotických teliesok) a ich fagocytózu makrofágmi.

Zvláštnosti fungovania pľúcnych makrofágov sú spojené s ich schopnosťou nielen fagocytózy, ale aj produkcie veľkého množstva cytokínov potrebných na aktiváciu a reguláciu mnohých extracelulárnych reakcií a procesov prebiehajúcich v ohnisku zápalu tuberkulózy. S ich pomocou sa vykonáva samoregulácia obnovy a diferenciácie mononukleárnych buniek, medzibunkové interakcie sa budujú za podmienok špecifického procesu a regenerácie.

Univerzálnym mediátorom medzibunkových interakcií je IL-1, ktorého cieľom sú lymfocyty, polymorfonukleárne leukocyty, fibroblasty, endotelocyty a ďalšie bunkové elementy. Zároveň je sekrečná funkcia pľúcnych makrofágov založená na princípoch samoregulácie, keď tá istá bunka vylučuje nielen regulátory extracelulárnych procesov, ale aj inhibítory, ktoré blokujú ich účinok. Sekrečné makrofágy sa od fagocytárnych výrazne líšia svojou ultraštrukturálnou organizáciou. Zriedkavo obsahujú fagozomálne vakuoly a sekundárne lyzozómy, ale majú vyvinutý vezikulárny aparát a ďalšie ultraštrukturálne znaky sekrécie. Obzvlášť dobre sa exprimujú v epiteloidných bunkách, ktoré sú hyperaktívnymi sekrečnými makrofágmi.

V materiáli z bronchoalveolárnej laváže možno pod svetelným a najmä elektrónovým mikroskopom jasne sledovať určité štádiá diferenciácie pľúcnych makrofágov. V závislosti od štrukturálnej organizácie jadra a cytoplazmy sa medzi nimi určujú mladé neaktivované a biosyntetické mononukleáre, ako aj zrelé fagocytujúce a sekrečné makrofágy. Mladé neaktivované bunky (s priemerom 15 – 18 μm) zvyčajne tvoria približne 1/5 všetkých makrofágových prvkov. Majú okrúhle jadro s hladkými kontúrami: cytoplazma je slabo bazofilná, neobsahuje žiadne inklúzie. Pod elektrónovým mikroskopom sú v týchto bunkách viditeľné zriedkavé profily cytoplazmatického retikula a mitochondrií, niekoľko malých granúl podobných lyzozómom a voľné ribozómy.

Aktivované, biosyntetické makrofágy sú väčšie (priemer 18-25 μm), jadro sa vyznačuje zvlnenými kontúrami a výrazným jadierko. Majú bazofilnú cytoplazmu, ktorá obsahuje vyvinuté dlhé kanáliky granulárnej cytoplazmatickej siete a početné polyzómy. Prvky lamelárneho komplexu sa detegujú súčasne v dvoch alebo troch zónach, kde sa hromadia primárne lyzozómy. Sekundárne lyzozómy sú reprezentované jednotlivými inklúziami; fagozómy sa detegujú zriedkavo, čo odráža pripravenosť bunky na fagocytárnu funkciu.

Priemer zrelých pľúcnych makrofágov sa značne líši (30-55 μm) v závislosti od aktivity a funkčnej orientácie buniek. Najväčšie veľkosti sú charakteristické pre makrofágy so štrukturálnymi znakmi výraznej fagocytózy. Povrch takýchto buniek tvorí početné mikrovýrastky a dlhé pseudopódie. Oválne alebo okrúhle jadro je často umiestnené acentricky, má vlnité kontúry. Významné množstvo kondenzovaného chromatínu leží v blízkosti jadrovej membrány, jadierko je malé (1-1,2 μm). V cytoplazme sa určujú inklúzie, krátke kanáliky granulárneho cytoplazmatického retikula, cisterny a vakuoly lamelárneho komplexu a voľné ribozómy. Bunky obsahujú významný počet mitochondrií, primárne (0,5-1 μm) a sekundárne (1,2-2 μm) lyzozómy, ako aj fagozomálne vakuoly, ktoré sa líšia veľkosťou a počtom. Tieto obsahujú fragmenty zničených bunkových prvkov a mykobaktérií tuberkulózy („nekrofágy“, „hemosiderofágy“), lamelárne inklúzie fosfolipidovej povahy („fosfolipofágy“) a/alebo granule neutrálneho tuku („lipofágy“), častice prachu, tabakovej živice, kaolínu („koniofágy“, „fajčiarske makrofágy“).

V prítomnosti konštantného objektu fagocytózy sa objavujú viacjadrové makrofágy (s priemerom viac ako 70 μm) s piatimi alebo viacerými jadrami. V granulómoch a granulačnom tkanive tuberkulóznych ložísk sa určujú typické cudzie telesá - konečné štádium diferenciácie makrofágu s fagocytárnou funkciou. Pľúcne makrofágy s výraznou sekrečnou aktivitou (priemer 25-40 μm) zvyčajne nemajú typické pseudopódie. Povahu povrchu možno prirovnať k tenkému čipkovanému vrúbku tvorenému početnými, relatívne krátkymi mikrovýrastkami. Okrúhle alebo oválne jadro obsahuje malé množstvo kondenzovaného chromatínu, číry veľký nukleolus (1,5-2 μm). Priehľadná cytoplazma prakticky neobsahuje veľké inklúzie. Krátke kanáliky granulárnej cytoplazmatickej siete sú reprezentované jednotlivými profilmi, zatiaľ čo dobre vyvinutými prvkami lamelárneho komplexu sú početné vakuoly a vezikuly s elektrónovo transparentným alebo osmiofilným obsahom. Rovnaké štruktúry sa detegujú aj v ektoplazme, kde sa priamo spájajú s plazmalemou. Aj u dlhoročných fajčiarov, u ktorých všetky fagocytujúce bunky obsahujú charakteristické inklúzie tabakového dechtu, majú sekretujúce makrofágy malý počet sekundárnych lyzozómov a jednotlivých fagozómom podobných útvarov, t. j. prakticky neabsorbujú cudzí materiál. Makrofágy s ultraštrukturálnymi znakmi sekrečnej aktivity za normálnych podmienok tvoria maximálne 4 – 8 % bronchoalveolárnej laváže. Keďže funkcia týchto buniek je spojená s metabolizmom, syntézou a uvoľňovaním mnohých biologicky aktívnych látok do extracelulárneho prostredia, akékoľvek narušenie mechanizmov špecifickej a nešpecifickej ochrany vedie k zvýšeniu ich počtu, tvorbe makrofágov so zvýšeným sekrečným potenciálom – epiteloidných buniek. Tvoria symplasty alebo sa v dôsledku neúplného mitotického delenia menia na charakteristické viacjadrové Pirogovove-Langhansove bunky – konečná diferenciácia makrofágu so sekrečnou aktivitou.

V závislosti od odolnosti tela, povahy pôsobenia a podmienok mikroprostredia majú procesy transformácie nahromadenej fagocytárnej, sekrečnej alebo antigén prezentujúcej aktivity svoje vlastné charakteristiky. Ukázalo sa, že výpočet relatívneho percenta morfofunkčných typov makrofágov v bronchoalveolárnej laváži (určenie makrofágového vzorca) pomáha v diferenciálnej diagnostike tuberkulózy a iných pľúcnych granulomatóz a umožňuje vyhodnotiť účinnosť etiotropnej liečby.

Pomer počtu aktívne fagocytujúcich a syntetizujúcich pľúcnych makrofágov nielen odráža povahu tkanivovej reakcie v oblasti zápalu tuberkulózy, ale môže slúžiť aj ako indikátor aktivity patologického procesu. Problém dokončenia fagocytózy pri tuberkulóze zostáva relevantný. Výsledky našich štúdií experimentálneho a klinického materiálu ukazujú, že výsledok interakcie medzi fagocytózou a patogénom závisí od funkčného stavu makrofágu a biologických vlastností mikroorganizmu.

Stav systému povrchovo aktívnych látok

Úspechy experimentálneho a teoretického smeru v štúdiu pľúcnych surfaktantov umožnili formulovať moderný koncept surfaktantu ako viaczložkového systému bunkových a nebunkových prvkov, ktorých štrukturálna a funkčná jednota zabezpečuje normálnu biomechaniku dýchania.

Doteraz sa nahromadilo určité množstvo faktického materiálu, ktorý svedčí nielen o významných adaptačných schopnostiach surfaktantov v podmienkach hlbokej reštrukturalizácie pľúcnej ventilácie a hemodynamiky, ale aj o výraznej citlivosti jeho zložiek na mnohé nepriaznivé faktory tuberkulózneho procesu, ktorých špecifická povaha je určená dĺžkou perzistencie patogénu, vlnovým priebehom procesu a hlbokými poruchami mikrocirkulácie. Pozorované zmeny v tomto prípade ovplyvňujú nielen zóny vzniku ložísk infekcie, ale aj vzdialené, aktívne fungujúce oblasti pľúcneho parenchýmu. V tejto súvislosti je mimoriadne dôležité vyhodnotiť morfofunkčnú užitočnosť rôznych zložiek surfaktantov, zdôrazniť tie zmeny, ktoré možno použiť na diagnostiku surfaktant-dependentných porúch dýchacích funkcií a ich včasnú korekciu.

Najskoršie príznaky deštrukcie pľúcneho surfaktantu možno pozorovať v modelových experimentoch s použitím špeciálnych metód fixácie pľúc. V počiatočnom štádiu vývoja tuberkulózneho zápalu majú lokálny charakter a prejavujú sa hlavne v zónach intraalveolárneho edému. Pod elektrónovým mikroskopom možno pozorovať rôzne štádiá odlupovania a deštrukcie vonkajšieho filmu - membrány surfaktantu edémovou tekutinou. Tieto zmeny sa plne prejavujú v ložiskách tuberkulózneho zápalu, kde sa materiál zničeného surfaktantu určuje všade v zložení intraalveolárneho obsahu.

Zaznamenané zmeny v extracelulárnej výstelke alveol sa vyskytujú v ložiskách rôznych bakteriálnych pneumónií. V tomto prípade časť A2, predovšetkým v perifokálnych alveolách, vykonáva kompenzačnú produkciu povrchovo aktívnych látok. Odlišný obraz sa pozoruje v dýchacích orgánoch počas rozvoja tuberkulózneho zápalu, pretože patogén má nepriaznivý vplyv na procesy intracelulárnej syntézy povrchovo aktívnych látok. Priame zavedenie tuberkulóznych mykobaktérií do pľúc psov (punkcia hrudníka) ukázalo, že v A2 sa už v prvých 15-30 minútach pozoruje dezorganizácia cytoplazmatického retikula a mitochondriálnych profilov; po niekoľkých hodinách sú alveolocyty v mieste infekcie úplne zničené. Rýchly rozvoj nedostatku povrchovo aktívnych látok vedie ku kolapsu alveol a rýchlemu šíreniu zápalového procesu do okolitého parenchýmu. V alveolách susediacich s ložiskami prevládajú malé mladé A2 s jednotlivými malými sekrečnými granulami alebo veľké bunky so známkami vakuolizácie intracelulárnych štruktúr, niekedy s úplne zničenou cytoplazmou. V tých alveolocytoch, kde sú vyvinuté prvky cytoplazmatickej siete a lamelárneho komplexu, sa detegujú obrovské osmiofilné lamelárne telieska (GLB), čo naznačuje oneskorenie (inhibíciu) uvoľňovania intracelulárneho surfaktantu na povrch alveol.

Matematické modelovanie sekrečnej funkcie A2 v pľúcnom parenchýme bez ložísk so zvýšenou funkčnou záťažou ukázalo, že napriek zvýšeniu objemu a numerickej hustoty zrelých sekrečných granúl sa rezervný potenciál populácie významne nezmenil. Zistilo sa, že za podmienok zvýšenej vaskulárnej permeability, rozvoja hypoxie a fibróznych zmien v interalveolárnych septách je rovnováha procesov tvorby a dozrievania OPT narušená smerom k prevahe druhých. Zrýchlené dozrievanie OPT často vedie k zvýšeniu elektrónovo transparentnej látky matrice v zložení sekrečných granúl, zatiaľ čo obsah osmiofilného povrchovo aktívneho materiálu v nich môže byť nevýznamný; lamelárny materiál povrchovo aktívnych látok je voľne usporiadaný a zaberá iba 1/3-1/5 objemu sekrečnej granuly. Výskyt významného množstva A2 s vakuolizovanými OPT možno vysvetliť narušením počiatočných štádií tvorby sekrétu. Takéto bunky majú zvyčajne ultraštrukturálne znaky deštrukcie (vyčistenie cytoplazmatickej matrice, edematózny opuch mitochondrií, tubuly cytoplazmatického retikula a lamelárneho komplexu), čo naznačuje pokles procesov intracelulárnej produkcie povrchovo aktívnych látok.

Je charakteristické, že pokles syntézy povrchovo aktívnych fosfolipidov je sprevádzaný výskytom neutrálnych lipidových granúl v cytoplazme A2. Adekvátnym odrazom porúch metabolizmu lipidov v pľúcach postihnutých tuberkulózou experimentálnych zvierat a ľudí je akumulácia makrofágov - lipofágov (penových buniek) rôzneho stupňa zrelosti v alveolách a bronchoalveolárnom výplachovom materiáli. Súbežne sa v lavážnej tekutine pozoruje spoľahlivý nárast obsahu neutrálnych lipidov a pokles podielu celkových fosfolipidov.

Jedným z prvých príznakov deštrukcie surfaktantov v experimente a klinickom obraze tuberkulózy dýchacích orgánov je strata schopnosti ich membrán tvoriť štruktúry rezervného materiálu. Namiesto toho možno na povrchu alveol, vo fagozómoch alveolárnych makrofágov a priamo v materiáli bronchoalveolárnej laváže vidieť membrány stočené do guľôčok („obrovské vrstevnaté guľôčky“) bez charakteristickej trojrozmernej organizácie. Hĺbku deštruktívnych zmien v systéme surfaktantov dokazuje aj frekvencia detekcie vylúčeného A2 vo výplachu. Tieto údaje korelujú s výsledkami biochemických a fyzikálno-chemických štúdií pľúcnych surfaktantov.

Berúc do úvahy všetky identifikované znaky, v súčasnosti sa na charakterizáciu stavu surfaktantov rozlišujú tri stupne jeho porúch: mierny, závažný a rozsiahly. Druhý stupeň odráža zvýšené riziko vzniku respiračného zlyhania závislého od surfaktantov u pacientov s rozsiahlymi deštruktívnymi formami ochorenia.

Výsledky štúdií ukazujú, že základom porúch, ktoré sa vyskytujú v systéme povrchovo aktívnych látok v pľúcach počas tuberkulózy, sú procesy spojené so zvýšením priepustnosti krvno-vzduchovej bariéry:

• poškodenie povrchovo aktívnej látky na alveolárnom povrchu;
• metabolické zmeny a poškodenie A2;
• narušenie mechanizmov na odstraňovanie odpadových povrchovo aktívnych látok z alveol.

Štúdie zároveň preukázali, že hlavným cytologickým mechanizmom podporujúcim funkčný potenciál systému povrchovo aktívnych látok v pľúcach zmenených tuberkulóznym zápalom je zvýšenie počtu hypertrofovaných A2, najmä v pľúcnom parenchýme vzdialenom od špecifického zamerania.

[ 11 ], [ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]

Genetické aspekty náchylnosti na tuberkulózu

Predtým, ako začneme s analýzou súčasného stavu výskumu v oblasti mechanizmov antituberkulóznej imunity a imunogenetiky tuberkulózy, považujeme za potrebné venovať sa niektorým všeobecným pozíciám.

• Po prvé, je známe, že mykobaktérie sa množia a ničia primárne v makrofágoch. Veľmi málo údajov (a tie si protirečia) naznačuje, že existujú nejaké faktory, ktoré môžu mykobaktérie ničiť extracelulárne.
• Po druhé, neexistujú žiadne presvedčivé dôkazy o tom, že systém neutrofilných fagocytov zohráva významnú úlohu v obrane proti tuberkulóznej infekcii.
• Po tretie, neexistuje žiadny presvedčivý dôkaz o tom, že protilátky proti TBC môžu buď ničiť mykobaktérie extracelulárne, alebo podporovať ich intracelulárnu deštrukciu v makrofágoch alebo iných typoch buniek.
• Po štvrté, existuje veľké množstvo faktov podporujúcich názor, že ústredným článkom v protituberkulóznej imunite sú T-lymfocyty a že svoj regulačný vplyv vykonávajú prostredníctvom fagocytového systému.
• Po piate, existuje množstvo dôkazov o tom, že dedičné faktory zohrávajú významnú úlohu pri infekcii tuberkulózy.

Údaje naznačujúce dôležitú úlohu genetických faktorov v náchylnosti na tuberkulózu u ľudí sú pomerne presvedčivé. V prvom rade to naznačuje skutočnosť, že pri extrémne vysokej miere infekcie M. tuberculosis (približne jedna tretina dospelej populácie planéty) sa ochorenie vyvíja len u malej časti ľudí. Naznačujú to aj rôzne úrovne náchylnosti na infekciu v rôznych etnických skupinách a charakter dedičnosti náchylnosti a rezistencie na tuberkulózu v rodinách s viacerými prípadmi ochorenia. Dôkazom tohto stanoviska je napokon aj výrazne zvýšená zhoda výskytu klinicky exprimovanej tuberkulózy u monozygotných (identických) dvojčiat v porovnaní s dizygotnými dvojčatami.

Tradičné genetické testovanie na tuberkulózu

Úloha hlavného histokompatibilného komplexu a NRAMP*

Identifikácia génov a ich alel, ktorých expresia určuje citlivosť alebo rezistenciu na tuberkulózu, by nielen umožnila hlboký vhľad do základných mechanizmov imunity a vývoja patologického procesu pri tuberkulóze, ale by tiež priblížila realite využitie metód genetickej typizácie na identifikáciu jedincov medzi zdravými ľuďmi s geneticky zvýšeným rizikom nákazy tuberkulózou, čo si vyžaduje prioritné preventívne opatrenia, najmä špeciálny prístup k očkovaniu.

* - Prirodzený makrofágový proteín spojený s rezistenciou - makrofágový proteín spojený s prirodzenou rezistenciou.

Existuje značný počet experimentálnych štúdií, ktoré ukazujú úlohu viacerých genetických systémov a jednotlivých génov (H2, BCG1, Tbc1, xid atď.) v rezistencii (citlivosti) na tuberkulózu u myší. U ľudí patria medzi najviac študované gény gény hlavného histokompatibilného komplexu (MHC) triedy II, medzi ktorými alelový komplex rodiny HLA-DR2 (ľudia) vykazuje pomerne vysoký stupeň asociácie so zvýšenou chorobnosťou v niekoľkých etnicky vzdialených populáciách a alely lokusu HLA-DQ ovplyvňujú klinický obraz tuberkulózy. Nedávno sa dosiahli prvé úspechy v analýze súvislosti génu NRAMP1 s tuberkulózou u ľudí. Tieto údaje sú obzvlášť pozoruhodné, pretože tento gén má vysoký stupeň homológie s génom NRAMP1 (predtým nazývaným BCG 1, pretože kontroluje náchylnosť na M. bovisBCG), ktorý je selektívne exprimovaný v myších makrofágoch a ktorý nepochybne ovplyvňuje náchylnosť na intracelulárne patogény (vrátane mykobaktérií).

Mutácie so stratou funkcie

Bolo identifikovaných niekoľko génov, ktorých zmeny, vedúce k úplnej strate schopnosti kódovať funkčne aktívny produkt (génový knockout), ovplyvnili najmä schopnosť myší vyvinúť ochrannú imunitnú odpoveď na infekciu mykobaktériami. Ide o gény kódujúce IFN-γ, IL-12, TNFα, ako aj receptory buniek imunitného systému pre uvedené cytokíny. Na druhej strane, s knockoutom génov kódujúcich IL-4 a IL-10 sa priebeh tuberkulóznej infekcie prakticky nelíšil od priebehu u myší divokého typu (počiatočných). Tieto údaje na genetickej úrovni potvrdili primárnu ochrannú úlohu pri tuberkulóze schopnosti imunitného systému (predovšetkým T1 lymfocytov) reagovať na infekciu produkciou cytokínov typu 1, ale nie typu 2.

Bola preukázaná použiteľnosť týchto údajov na mykobakteriálne infekcie u ľudí. Vo veľmi zriedkavých rodinách, v ktorých deti trpeli opakovanými mykobakteriálnymi infekciami a salmonelózou od útleho veku, je extrémne vysoká náchylnosť spôsobená homozygotnými nekonzervatívnymi mutáciami v génoch kódujúcich bunkové receptory pre IFN-γ a IL-12, zdedenými od rodičov heterozygotných pre tieto mutácie; ako sa očakávalo, pri takomto dedičstve zriedkavých mutácií sa manželstvá ukázali byť úzko súvisiace. Takéto hrubé porušenia však vedú k takej vysokej náchylnosti na infekcie, že prakticky neumožňujú dieťaťu prežiť viac ako niekoľko rokov, a to len v takmer sterilných podmienkach.

Tieto isté úvahy vedú k trochu skeptickému hodnoteniu prístupu modelovania infekcií u zvierat s knockout mutáciami v génoch, ktoré hrajú primárnu úlohu v ochrane pred týmito infekciami. Takéto mutácie vedú k expresii fenotypov, ktoré za normálnych podmienok nemajú šancu na prežitie a boli by rýchlo eliminované selekciou. Myši, ktoré neexprimujú produkty MHC triedy II a v dôsledku toho nemajú normálny pool CD4 lymfocytov, teda uhynú na diseminovanú infekciu v krátkom čase po infekcii M. tuberculosis. Veľmi podobný priebeh tuberkulózy sa pozoruje u ľudí s výrazným poklesom počtu CD4 buniek v neskorých štádiách AIDS. Pri riešení otázok genetického určenia rizikových skupín a vo všeobecnosti pri pochopení genetických príčin zvýšenej náchylnosti v rámci normálneho rozloženia populácie sa výskumník zaoberá jedincami, ktorí síce nie sú optimálni (podľa tohto znaku), ale sú celkom životaschopní. Tento aspekt problému hovorí v prospech použitia tradičnejších experimentálnych modelov pre genetickú analýzu, napríklad interlineárne rozdiely v priebehu tuberkulózy u myší.

Skríning genómu a predtým neznáme gény náchylnosti na tuberkulózu

Už v 50. a 60. rokoch 20. storočia sa ukázalo, že dedičnosť znakov náchylnosti a rezistencie na tuberkulózu u laboratórnych zvierat je komplexná a polygénna. V tejto situácii je potrebné po prvé vybrať jasne vyjadrené, „extrémne odlišné“ fenotypy medzi náchylnými a rezistentnými zvieratami alebo jedincami, teda charakteristiky ochorenia, a potom študovať povahu ich dedičnosti. Po druhé, je potrebné vziať do úvahy, že a priori nemáme predstavu o tom, koľko génov sa podieľa na kontrole ochorenia a ako sú umiestnené v genóme. Preto je potrebné buď vopred znížiť genetickú diverzitu v skúmanej populácii, segregovať podľa skúmaného znaku pomocou genetických techník (čo je možné len v experimentoch na zvieratách), alebo skríningovať celý genóm pomocou štatistických metód kvantitatívnej genetiky namiesto Mendelovej genetiky, alebo tieto techniky kombinovať. Po vývoji metód skenovania genómu pomocou PCR pre mikrosatelitné oblasti DNA a štatistického spracovania a interpretácie výsledkov sa genetická analýza náchylnosti na tuberkulózu dostala na novú úroveň.

Vyššie uvedené prístupy boli nedávno úspešne aplikované v genetických experimentoch na lineárnych myšiach dvoma skupinami výskumníkov. Skupina autorov z Centrálneho výskumného ústavu tuberkulózy Ruskej akadémie lekárskych vied spolu s kolegami z Centra pre štúdium rezistencie hostiteľa na McGill University (Montreal, Kanada) a Kráľovského štokholmského inštitútu ako prví vykonali genomický skríning dedičnosti závažnosti ochorenia spôsobeného intravenóznym podaním vysokej dávky kmeňa M. tuberculosis H37Rv u myší. Ako rodičovské línie s opačnou náchylnosťou na tuberkulózu boli použité línie A/Sn (rezistentná) a I/St (citlivá). Spoľahlivá väzba náchylnosti u samíc sa zistila na najmenej tri rôzne lokusy nachádzajúce sa na chromozómoch 3, 9 a 17. Nedávno sa väzba na lokusy v proximálnej časti chromozómu 9 a centrálnej časti chromozómu 17 preukázala aj u samcov. Najsilnejšia väzba na náchylnosť sa zistila pre lokus na chromozóme 9. Ďalšia skupina výskumníkov v Spojených štátoch skríningovala genóm myši, aby určila vzorec dedičnosti znaku náchylnosti u kmeňa M. tuberculosa Erdman. V kombinácii myších línií C57BL/6J (v ich modeli rezistentná) a C3HeB/FeJ (citlivá) bol pri analýze hybridov F2 a následne potomstva BC1 zmapovaný lokus v centrálnej časti chromozómu 1, ktorý riadi závažnosť ochorenia. Po počiatočnom mapovaní sa pomocou rekombinačnej analýzy dosiahla presnejšia lokalizácia lokusu a jeho vplyv na taký dôležitý fenotypový znak, ako je závažnosť granulomatózneho poškodenia pľúcneho tkaniva, bol stanovený u spätne krížených myší (generácia BC3), t. j. po významnom znížení genetickej diverzity medzi skúmanými zvieratami pomocou genetických techník. Je dôležité poznamenať, že mapovaný lokus označený ako sst1 (náchylnosť na tuberkulózu 1), hoci sa nachádza na chromozóme 1, zjavne nie je identický s lokusom NRAMP1. Dôkazom toho je jeho lokalizácia na chromozóme aj skutočnosť, že myši C57BL/6 nesú alelu citlivosti na BCG pre gén NRAMP1, ale alelu rezistencie na M tuberculosis pre lokus sst1.

Údaje publikované v posledných rokoch o prítomnosti lokusov v genóme myši, ktoré zásadne ovplyvňujú povahu procesu tuberkulózy, nám umožňujú dúfať vo významný pokrok v tejto oblasti a v analýze genetickej predispozície u ľudí. Fantasticky rýchly pokrok v genomickej analýze s najväčšou pravdepodobnosťou umožní veľmi rýchly prechod od genetiky tuberkulózy myší ku genetike ľudskej tuberkulózy, keďže kompletná sekvencia genómu ľudí aj myší bola prakticky dešifrovaná.

Interakcia makrofágov a mykobaktérií

Makrofágy zohrávajú mimoriadne dôležitú úlohu v obrane proti tuberkulóznej infekcii, a to ako vo fáze rozpoznávania antigénov, tak aj v eliminácii mykobaktérií.

Po vstupe mykobaktérií do pľúc sa situácia môže vyvinúť podľa štyroch hlavných vzorcov:

• primárna odpoveď hostiteľa môže byť dostatočná na úplné odstránenie všetkých mykobaktérií, čím sa eliminuje možnosť tuberkulózy;
• V prípade rýchleho rastu a rozmnožovania mikroorganizmov sa vyvíja ochorenie známe ako primárna tuberkulóza;
• pri latentnej infekcii sa ochorenie nevyvíja, ale mykobaktérie pretrvávajú v tele v takzvanom spiacom stave a ich prítomnosť sa prejavuje iba vo forme pozitívnej kožnej reakcie na tuberkulín;
• V niektorých prípadoch sú mykobaktérie schopné prejsť z dormantného stavu do rastovej fázy a latentnú infekciu nahradí reaktivácia tuberkulózy.

Prvou obrannou líniou proti infekcii po tom, čo mykobaktérie dosiahnu dolné dýchacie cesty, sú alveolárne makrofágy. Tieto bunky sú schopné priamo potláčať rast baktérií ich fagocytózou. Zúčastňujú sa tiež na širokej škále bunkových imunitných reakcií proti tuberkulóze – prostredníctvom prezentácie antigénu, stimulácie akumulácie T-lymfocytov v mieste zápalu atď. Je dôležité poznamenať, že špecifické mechanizmy väzby virulentných a relatívne avirulentných kmeňov mykobaktérií na fagocyty sa môžu líšiť.

Existujú dostatočné dôkazy o tom, že proces tvorby vakuol alebo fagozómov počas interakcie M. tuberculosis s mononukleárnym fagocytom je sprostredkovaný pripojením mikroorganizmu k receptorom komplementu (CR1, CR3, CR4), manózovým receptorom alebo iným receptorom na povrchu buniek. Interakcia medzi manózovými receptormi fagocytujúcich buniek a mykobaktérií je zrejme sprostredkovaná glykoproteínom bunkovej steny mykobaktérií - lipoarabinomananom.

Cytokíny T-pomocníkov typu 2 - prostaglandín E2 a IL-4 - stimulujú expresiu CR a MR a IFN-γ naopak potláča expresiu a funkciu týchto receptorov, čo vedie k zníženiu adhézie mykobaktérií na makrofágy. Naďalej sa hromadia aj údaje o účasti receptorov pre povrchovo aktívne proteíny na prichytávaní baktérií na bunky.

Úloha molekuly CD14 (fagocytového markera) bola demonštrovaná pomocou modelu interakcie medzi mykobaktériami a mikrogliami, rezidentnými fagocytmi mozgového tkaniva. Zistilo sa, že protilátky proti CD14 zabránili infekcii mikrogliálnych buniek virulentným laboratórnym kmeňom H37Rv. Keďže molekula CD14 nepreniká cez bunkovú membránu a nemá s cytoplazmou priamy kontakt, nie je schopná samostatne prenášať signál indukovaný lipoproteínmi, ale vyžaduje koreceptor na aktiváciu intracelulárnych dráh prenosu signálu. Najpravdepodobnejšími kandidátmi na takéto koreceptory sú zástupcovia rodiny Toll-like receptorov. Mikrobiálne lipoproteíny môžu prostredníctvom aktivácie týchto receptorov na jednej strane potenciovať obranné mechanizmy hostiteľského organizmu a na druhej strane spôsobiť poškodenie tkaniva indukciou apoptózy. Zároveň je apoptóza schopná inhibovať imunitnú odpoveď elimináciou buniek zapojených do imunitných reakcií, čím sa znižuje poškodenie tkanív.

Okrem vyššie uvedeného sa zdá dosť pravdepodobné, že významnú úlohu v procese prichytávania mykobaktérií na fagocytujúce bunky zohrávajú tzv. „scavenger“ receptory, ktoré sa nachádzajú na povrchu makrofágov a majú afinitu k množstvu ligandov.

Osud M. tuberculosis po fagocytóze spočíva v potlačení jej rastu makrofágmi. Po vstupe do fagozómu sú patogénne baktérie vystavené množstvu faktorov zameraných na ich zničenie. Medzi takéto faktory patrí fúzia fagozómu s lyzozómami, syntéza reaktívnych kyslíkových radikálov a syntéza reaktívnych dusíkatých radikálov, najmä oxidu dusnatého. K smrti mykobaktérií vo vnútri makrofágu môže dôjsť niekoľkými mechanizmami v dôsledku komplexných interakcií medzi lymfocytmi a fagocytmi sprostredkovaných cytokínmi. Je možné, že schopnosť mykobaktérií vyhnúť sa toxickým účinkom reaktívnych kyslíkových a dusíkatých radikálov je kľúčovým krokom pri prechode do latentného štádia infekcie. Schopnosť makrofágu potlačiť rast M. tuberculosis významne závisí od štádia aktivácie buniek (aspoň čiastočne) a od rovnováhy cytokínov (pravdepodobne predovšetkým od rastového faktora alfa odvodeného z krvných doštičiek (TGF-α) a IFN-γ).

Dôležitou súčasťou mechanizmu antimykobakteriálnej aktivity makrofágov je zrejme apoptóza (programovaná bunková smrť). V modeli kultivácie M. bovis BCG v monocytoch sa ukázalo, že apoptóza (ale nie nekróza) makrofágov je sprevádzaná znížením životaschopnosti fagocytovaných mykobaktérií.

Úloha T-lymfocytov v protituberkulóznej imunite

Je známe, že T-lymfocyty sú hlavnou zložkou získanej imunity pri tuberkulóznej infekcii. Imunizácia experimentálnych zvierat mykobakteriálnymi antigénmi, ako aj priebeh tuberkulóznej infekcie, sú sprevádzané tvorbou antigén-špecifických lymfocytov CD4 ⁺ a CD8 ⁺.

Deficit CD4 a v menšej miere CD8 lymfocytov pozorovaný u myší s knockoutom génov CD4, CD8, MHCII, MHCI, ako aj po podaní protilátok špecifických pre antigény CD4 alebo CD8, vedie k významnému zníženiu rezistencie myší voči infekcii M. tuberculosis. Je známe, že pacienti s AIDS, ktorí sa vyznačujú deficitom CD4 ⁺ lymfocytov, majú extrémne vysokú citlivosť na tuberkulózu. Relatívny príspevok CD4 ⁺ a CD8 ^{+ lymfocytov k ochrannej imunitnej odpovedi sa môže meniť v rôznych štádiách infekcie. V pľúcnych granulómoch myší infikovaných M. bovis BCG teda prevládajú CD4+} T lymfocyty v skorých štádiách infekcie (2-3 týždne), zatiaľ čo obsah CD8 ⁺ lymfocytov sa v neskorších štádiách zvyšuje. Počas adoptívneho prenosu majú CD8 ^{+ lymfocyty, najmä ich subpopulácia CD44hl}, vysokú ochrannú aktivitu. Okrem CD4 ⁺ a CD8 ⁺ lymfocytov sa vyskytujú aj iné subpopulácie lymfocytov, najmä γδ a CD4 ⁺ CD8 ^{+ lymfocyty,}, obmedzené nepolymorfnými molekulami triedy MHC CD1. tiež zrejme prispievajú k ochrannej imunite proti tuberkulóznej infekcii. Mechanizmy efektorového účinku T-lymfocytov sa redukujú hlavne na produkciu rozpustných faktorov (cytokínov, chemokínov) alebo cytotoxicitu. Pri mykobakteriálnych infekciách dochádza k prevažnej tvorbe T1, ktorého charakteristickými znakmi sú produkcia cytokínov IFN-γ a TNF-α. Oba cytokíny sú schopné stimulovať antimykobakteriálnu aktivitu makrofágov, ktorá je primárne zodpovedná za ochranný účinok CD4 lymfocytov. Okrem toho je IFN-γ schopný potlačiť závažnosť zápalových reakcií v pľúcach a tým znížiť závažnosť tuberkulóznej infekcie. TNF-α je nevyhnutný pre tvorbu granulómov, plnú spoluprácu makrofágov a lymfocytov a ochranu tkaniva pred nekrotickými zmenami. Okrem ochranného účinku má TNF-α aj „patologický“ účinok. Jeho produkcia môže viesť k horúčke, úbytku hmotnosti a poškodeniu tkaniva – symptómom charakteristickým pre tuberkulóznu infekciu. T-lymfocyty nie sú jediným zdrojom TNF-α. Jeho hlavnými producentmi sú makrofágy. Účinok TNF-α je do značnej miery určený úrovňou produkcie iných cytokínov typu 1 a 2 v zápalovom ohnisku. V podmienkach prevládajúcej produkcie cytokínov typu 1 a absencie produkcie cytokínov typu 2 má TNF-α ochranný účinok a pri súčasnej produkcii cytokínov typu 1 a 2 má deštruktívny účinok. Keďže, ako je uvedené vyššie, mykobaktérie stimulujú hlavne T1 lymfocyty, priebeh mykobakteriálnych infekcií zvyčajne nie je sprevádzaný zvýšením produkcie IL-4 a IL-5. Zároveň pri závažných formách infekcie, ako aj v jej neskorých štádiách, môže dôjsť k lokálnemu a systémovému zvýšeniu produkcie IL-4 a IL-5. Nie je jasné, či je zvýšená produkcia cytokínov typu 2 príčinou závažnejšej tuberkulóznej infekcie alebo jej dôsledkom.

Cytotoxicitu voči infikovaným cieľovým bunkám prejavujú bunky CD8 ⁺, ako aj „neklasické“ CD8 ⁺ lymfocyty obmedzené molekulami CDlb, CD4 ⁺ CD8 ⁺ lymfocyty a CD4 ⁺ lymfocyty. Dôležitosť cytotoxicity v ochrane pred tuberkulózou naznačuje zníženie cytotoxickej aktivity CD8 ⁺ lymfocytov a obsahu perforínu u pacientov s tuberkulózou v porovnaní so zdravými darcami. Je nevyhnutné odpovedať na otázku, ako môže lýza infikovaných cieľových buniek ovplyvniť priebeh infekčného procesu: vedie k zníženiu intenzity reprodukcie mykobaktérií, ktoré sú intracelulárnymi parazitmi, alebo naopak podporuje uvoľňovanie mykobaktérií z infikovaných makrofágov a infekciu nových buniek. Zdá sa, že údaje S. Strongera (1997) môžu prispieť k pochopeniu tohto problému. Autori ukázali, že cytotoxické lymfocyty obsahujú molekuly granulyzínu, ktoré majú baktericídny účinok na mykobaktérie. Aby granulyzín prenikol do infikovaných buniek, lymfocyty musia vylučovať proteíny, ktoré tvoria póry v membráne cieľových buniek. Takto sa po prvýkrát získali údaje o priamej deštrukcii mykobaktérií (v makrofágoch) T-lymfocytmi, čím sa preukázala možnosť priamej účasti T-lymfocytov na ochrane pred mykobakteriálnymi infekciami.

Regulácia imunitnej odpovede T-buniek

Reakcia T lymfocytov a ich produkcia efektorových cytokínov sú regulované cytokínmi produkovanými bunkami prezentujúcimi antigén, vrátane infikovaných makrofágov. IL-12 posúva diferenciáciu T lymfocytov smerom k tvorbe Th1 buniek a stimuluje produkciu IFN-γ. Infekcia myší s IL-12 ^% M. bovis BCG vedie k progresívnemu rozvoju infekcie, zvýšenému šíreniu mykobaktérií a je sprevádzaná absenciou tvorby granulómov v pľúcach. U myší s IL-12p40 ^% infikovaných M. tuberculosis sa pozoruje nekontrolovaný rast mykobaktérií, spojený s porušením prirodzenej rezistencie aj získanej imunity a spôsobený významným poklesom produkcie prozápalových cytokínov IFN-γ a TNF-β. Naopak, podávanie rekombinantného IL-12 myšiam s následnou infekciou M. tuberculosis Erdmann vedie k zvýšeniu ich rezistencie voči infekcii.

IL-10 je regulačný cytokín, ktorý stimuluje rozvoj humorálnych imunitných reakcií a potláča mnohé reakcie bunkovej imunity. Predpokladá sa, že účinok IL-10 na odpoveď T-buniek môže byť sprostredkovaný jeho pôsobením na makrofágy: IL-10 inhibuje prezentáciu antigénov makrofágmi a potláča syntézu prozápalových cytokínov TNF-α, IL-1, IL-6, IL-8 a IL-12, GM-CSF, G-CSF makrofágmi. IL-10 má tiež antiapoptotický účinok. Zdá sa, že takéto spektrum účinku by malo určovať významný vplyv IL-10 na intenzitu antituberkulóznej imunity, avšak údaje o závislosti ochrannej imunity od produkcie IL-10 sú mimoriadne protichodné.

TGF-β je jedinečný faktor potláčajúci bunkovú imunitu. Jeho hladina produkcie koreluje so závažnosťou tuberkulózy a podávanie protilátok proti TGF-β alebo prirodzených inhibítorov TGF-β myšiam infikovaným M. tuberculosis koriguje zníženú odpoveď T-buniek.

Treba poznamenať, že efektorová úloha T-lymfocytov sa neobmedzuje len na produkciu cytokínov a bunkovú cytotoxicitu. Ďalšie procesy, ktoré prebiehajú počas nadväzovania priameho kontaktu medzi T-lymfocytmi a makrofágmi, ako aj produkcia chemokínov T-lymfocytmi, môžu významne prispieť k rozvoju lokálnych zápalových reakcií. Tie zase nie sú spôsobené len reakciou makrofágov a T-lymfocytov. Neutrofily, eozinofily, fibroblasty, epitelové a ďalšie bunky môžu byť aktívnymi účastníkmi procesov prebiehajúcich v pľúcach počas tuberkulóznej infekcie.

Morfologické štúdie procesu tvorby granulómov, ako aj výsledky stanovenia dynamiky tvorby špecifickej T-bunkovej odpovede, podľa nášho názoru umožňujú rozlíšiť niekoľko štádií interakcie mykobaktérií s makroorganizmom. Prvé je charakterizované progresívnou proliferáciou mykobaktérií v neprítomnosti špecifickej odpovede T-lymfocytov a trvá približne 2-3 týždne. Druhé nastáva po vzniku zrelých T-lymfocytov a je charakterizované stabilizáciou rastu mykobaktérií. Spravidla nasleduje štádium dekompenzácie, ktoré sa časovo zhoduje s deštrukciou lymfoidných útvarov a výskytom nekrotických zmien v pľúcach. Účinok vakcíny môže byť spôsobený znížením prvej fázy odpovede.