Kmeňové bunky a regeneratívna plastická medicína

Dnes je len málo praktizujúcich lekárov, ktorí nevedia o vývoji nového smeru v liečbe najťažších ochorení, ktoré boli predtým nevyliečiteľné tradičnou a alternatívnou medicínou. Hovoríme o regeneratívno-plastickej medicíne, založenej na využití regeneračného potenciálu kmeňových buniek. Okolo tohto rozvíjajúceho sa smeru vznikla nebývalá vedecká diskusia a pseudovedecký humbuk, ktorý vznikol do značnej miery vďaka informačným hyperbolám World Wide Webu. Laboratórne štúdie terapeutických schopností kmeňových buniek za veľmi krátky čas prekročili rámec experimentu a začali sa aktívne zavádzať do praktickej medicíny, čo viedlo k množstvu problémov vedeckej, etickej, náboženskej, právnej a legislatívnej povahy. Štátne a verejné inštitúcie sa jednoznačne ukázali byť nepripravené na rýchlosť prechodu kmeňových buniek z Petriho misiek do systémov na intravenózne podávanie, čo nie je prospešné ani pre spoločnosť ako celok, ani pre konkrétneho trpiaceho človeka. Nie je ľahké pochopiť nepredstaviteľné množstvo informácií o možnostiach kmeňových buniek, a to ako v kvantite, tak aj v kvalite, a to ani pre špecialistov (ktorých nie je, keďže každý sa snaží zvládnuť nový vedecký trend sám), nehovoriac o lekároch, ktorí sa priamo nepodieľajú na regeneratívnej plastickej medicíne.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

Prečo sú takéto experimenty potrebné a sú vôbec potrebné?

Na prvý pohľad je vytvorenie bunkových medzidruhových chimér ovocím nespútanej fantázie fanatického vedca, ktorý zabudol na bioetiku. Práve tento prístup však výrazne rozšíril naše základné poznatky o embryogenéze, pretože umožnil vypočítať počet buniek potrebných pre organogenézu (tvorbu pečene, mozgu, kože a orgánov imunitného systému). Okrem toho (možno je to v biológii ESC to hlavné) dostali genetici k dispozícii jedinečný nástroj, pomocou ktorého je možné počas chimerizácie embryí stanoviť funkčný účel génov. Najprv sa pomocou špeciálnej techniky dvojitého knockoutu „vypne“ študovaný pár génov v ESC. Potom sa takéto ESC zavedú do blastocysty a monitorujú sa zmeny, ktoré sa vyskytujú v tele vyvíjajúceho sa chimérického embrya. Týmto spôsobom boli stanovené funkcie génov sf-1 (vývoj nadobličiek a pohlavných orgánov), urt-l (útvar obličiek), muoD (vývoj kostrového svalstva) a gata-l-4 (útvar erytropoézy a lymfopoézy). Okrem toho je možné do ESC laboratórnych zvierat vložiť (transfekovať) ľudské gény, ktoré doteraz neboli študované, aby sa určila ich funkcia pomocou chimérického embrya.

Ale spravidla zdôvodnenie experimentu získaním nových základných poznatkov nenachádza podporu u širokého publika. Uveďme príklad aplikovaného významu chimerizácie pomocou ESC. V prvom rade ide o xenotransplantáciu, teda transplantáciu zvieracích orgánov ľuďom. Teoreticky nám vytvorenie chimér ľudsko-bravčových buniek umožňuje získať zviera, ktoré je antigénnymi vlastnosťami oveľa bližšie k darcovi ESC, čo v rôznych klinických situáciách (diabetes mellitus, cirhóza pečene) môže zachrániť život chorého človeka. Na to sa však musíme najprv naučiť, ako vrátiť vlastnosť totipotencie genómu zrelej somatickej bunky, po ktorej ju možno zaviesť do vyvíjajúceho sa embrya ošípaného.

Dnes sa schopnosť embryonálnych kmeňových buniek (ESC) deliť takmer donekonečna za špeciálnych kultivačných podmienok využíva na produkciu totipotentnej bunkovej hmoty s jej následnou diferenciáciou na špecializované bunky, ako sú dopaminergné neuróny, ktoré sa potom transplantujú pacientovi s Parkinsonovou chorobou. V tomto prípade transplantácii nevyhnutne predchádza cielená diferenciácia získanej bunkovej hmoty na špecializované bunky potrebné na ošetrenie a čistenie týchto buniek od nediferencovaných bunkových elementov.

Ako sa neskôr ukázalo, hrozba karcinogenézy nebola ani zďaleka jedinou prekážkou transplantácie buniek. ESC v embryoidných telieskach sa spontánne diferencujú heterogénne, to znamená, že tvoria deriváty širokej škály bunkových línií (neuróny, keratinocyty, fibroblasty, endotelocyty). V zornom poli mikroskopu sa v tomto prípade spomedzi buniek rôznych fenotypov vyznačujú kardiomyocyty, z ktorých každý sa sťahuje vo svojom vlastnom rytme. Na liečbu pacienta je však potrebné mať čisté bunkové populácie: neuróny - pri mozgovej príhode, kardiomyocyty - pri infarkte myokardu, β-bunky pankreasu - pri diabete mellitus, keratinocyty - pri popáleninách atď.

Ďalšia etapa vývoja bunkovej transplantológie bola spojená s vývojom technológií na získanie dostatočného počtu (milióny buniek) takýchto čistých bunkových populácií. Hľadanie faktorov spôsobujúcich cielenú diferenciáciu ESC malo empirický charakter, pretože postupnosť ich syntézy počas embryogenézy zostala neznáma. Najprv sa zistilo, že tvorba žĺtkového vaku je indukovaná pridaním cAMP a kyseliny retinovej do kultúry ESC. Hematopoetické bunkové línie boli vytvorené v prítomnosti 1L-3, SCF, fibroblastového rastového faktora (FGH), inzulínu podobného rastového faktora (IGF-1), 1L-6 a faktora stimulujúceho kolónie granulocytov (G-СSF) v kultivačnom médiu. Bunky nervového systému boli vytvorené z ESC po odstránení LIF a vrstvy fibroblastov, ktorá slúžila ako výživná látka. Po ošetrení kyselinou retinovou v prítomnosti fetálneho séra sa ESC začali diferencovať na neuróny a kardiomyocyty boli získané pridaním dimetylsulfoxidu (DMSO), ktorý zabezpečuje cielené dodávanie hydrofóbnych signálnych molekúl do bunkového jadra. V tomto prípade akumulácia aktívnych foriem kyslíka v kultivačnom médiu, ako aj elektrická stimulácia, prispeli k tvorbe zrelých kontraktilných kardiomyocytov.

Obrovské úsilie a zdroje sa vynaložili na hľadanie podmienok pre diferenciáciu embryonálnych kmeňových buniek (ESC) na bunky pankreasu produkujúce inzulín. Čoskoro sa však ukázalo, že z ESC nevznikne množstvo špecializovaných bunkových línií (pankreatické β-bunky, imunitné a endokrinné bunky, adipocyty), ak sú stimulované podľa princípu „jeden stimulačný faktor - jedna bunková línia“. Tento princíp sa ukázal byť platný len pre obmedzený počet bunkových línií. Tvorbu neurónov možno indukovať najmä kyselinou retínovou, svalovou bunkovou líniou transformačným rastovým faktorom β (TCP-β), erytroidnými líniami 1L-6 a monocytovo-myeloidnou líniou 1L-3. Okrem toho sa ukázalo, že účinky týchto faktorov na diferenciáciu ESC sú prísne závislé od dávky.

Začala sa fáza hľadania kombinácií rastových faktorov, ktoré by posunuli ESC do neskorších štádií embryogenézy s tvorbou mezodermu (zdroj kardiomyocytov, kostrových svalov, epitelu renálnych tubulov, myeloerytropoézy a buniek hladkého svalstva), ektodermu (epidermis, neuróny, sietnica) a endodermu (epitel tenkého čreva a sekrečných žliaz, pneumocyty). Príroda akoby nútila výskumníkov napredovať po ceste embryogenézy, opakovať jej štádiá v Petriho miske a nedávať im možnosť okamžite a ľahko dosiahnuť požadovaný výsledok. A takéto kombinácie rastových faktorov sa našli. Aktivín A v kombinácii s TGF-β sa ukázal byť silným stimulátorom tvorby mezodermálnych buniek z ESC a zároveň blokovať vývoj endodermu a ektodermu. Kyselina retínová a kombinácia signálov morfogenetického proteínu kostnej drene (BMP-4) a epidermálneho rastového faktora (EGF) aktivujú tvorbu ekto- a mezodermálnych buniek, čím zastavujú vývoj endodermu. Pozoruje sa intenzívny rast buniek všetkých troch zárodočných vrstiev pri súčasnom účinku dvoch faktorov na ESC - rastového faktora hepatocytov (HGF) a rastového faktora nervových buniek.

Na získanie potrebných bunkových línií je teda potrebné najprv preniesť embryonálne kmeňové bunky do štádia tvorby buniek určitej zárodočnej vrstvy a potom vybrať novú kombináciu rastových faktorov schopných indukovať cielenú diferenciáciu ekto-, mezo- a endodermu na špecializované bunky potrebné na transplantáciu pacientovi. Počet kombinácií rastových faktorov sa dnes pohybuje v tisíckach, väčšina z nich je patentovaná, niektoré biotechnologické spoločnosti vôbec nezverejňujú.

Nastal čas na purifikáciu získaných buniek od nediferencovaných bunkových nečistôt. Bunky diferencované v kultúre boli označené markermi zrelých bunkových línií a prešli cez vysokorýchlostný laserový imunofenotypový triedič. Laserový lúč ich našiel v bežnom bunkovom toku a nasmeroval ich samostatnou cestou. Laboratórne zvieratá boli prvé, ktoré dostali získaný purifikovaný bunkový materiál. Nastal čas na vyhodnotenie účinnosti použitia derivátov ESC na modeloch chorôb a patologických procesov. Jedným z takýchto modelov bola experimentálna Parkinsonova choroba, ktorá sa u zvierat dobre reprodukuje pomocou chemických zlúčenín, ktoré ničia dopaminergné neuróny. Keďže ochorenie u ľudí je založené na získanom deficite dopaminergných neurónov, použitie substitučnej bunkovej terapie bolo v tomto prípade patogeneticky opodstatnené. U zvierat s experimentálnym hemiparkinsonizmom sa uchytila približne polovica dopaminergných neurónov získaných z ESC a zavedených do mozgových štruktúr. To stačilo na významné zníženie klinických prejavov ochorenia. Pokusy o obnovenie funkcie poškodených štruktúr CNS pri experimentálnych mozgových príhodách, úrazoch a dokonca aj ruptúrach miechy sa ukázali ako pomerne úspešné.

Treba však poznamenať, že takmer všetky prípady úspešného použitia diferencovaných derivátov ESC na korekciu experimentálnej patológie boli vykonané v akútnom období simulovanej patologickej situácie. Výsledky liečby na diaľku neboli také upokojujúce: po 8-16 mesiacoch pozitívny účinok transplantácie buniek zmizol alebo prudko klesol. Dôvody sú celkom jasné. Diferenciácia transplantovaných buniek in vitro alebo in loco morbi nevyhnutne vedie k expresii bunkových markerov genetickej cudzorodosti, čo vyvoláva imunitný útok zo strany tela príjemcu. Na vyriešenie problému imunologickej nekompatibility sa použila tradičná imunosupresia, súbežne s ktorou sa v klinických štúdiách začal realizovať potenciál transdiferenciácie a genetickej korekcie autológnych hematopoetických a mezenchymálnych kmeňových buniek, ktoré nespôsobujú imunitný konflikt.

Čo je regeneratívna plastická medicína?

Evolúcia určila dve hlavné možnosti ukončenia života bunky - nekrózu a apoptózu, ktoré na úrovni tkaniva zodpovedajú procesom proliferácie a regenerácie. Proliferáciu možno považovať za druh obety, keď dochádza k vyplneniu defektu poškodeného tkaniva v dôsledku jeho nahradenia prvkami spojivového tkaniva: pri zachovaní štrukturálnej integrity telo čiastočne stráca funkciu postihnutého orgánu, čo určuje následný vývoj kompenzačných reakcií s hypertrofiou alebo hyperpláziou štrukturálnych a funkčných prvkov, ktoré zostávajú neporušené. Trvanie kompenzačného obdobia závisí od objemu štrukturálnych lézií spôsobených faktormi primárnej a sekundárnej alterácie, po ktorých vo veľkej väčšine prípadov dochádza k dekompenzácii, prudkému zhoršeniu kvality a skráteniu trvania ľudského života. Fyziologická regenerácia zabezpečuje remodelačné procesy, teda nahradenie starnúcich a umierajúcich buniek mechanizmami prirodzenej bunkovej smrti (apoptózy) novými, ktoré pochádzajú z rezerv kmeňových buniek ľudského tela. Procesy reparatívnej regenerácie zahŕňajú aj bunkové zdroje kmeňových priestorov, ktoré sa však mobilizujú za patologických stavov spojených s ochorením alebo poškodením tkaniva a iniciujú bunkovú smrť prostredníctvom mechanizmov nekrózy.

Zvýšená pozornosť vedcov, lekárov, tlače, televízie a verejnosti venovaná problému štúdia biológie embryonálnych kmeňových buniek (ESC) je spôsobená predovšetkým vysokým potenciálom bunkovej alebo, ako ju nazývame, regeneratívno-plastickej terapie. Vývoj metód liečby najzávažnejších ľudských ochorení (degeneratívna patológia centrálneho nervového systému, poranenia miechy a mozgu, Alzheimerova a Parkinsonova choroba, skleróza multiplex, infarkt myokardu, arteriálna hypertenzia, diabetes mellitus, autoimunitné ochorenia a leukémia, popáleniny a neoplastické procesy tvoria zďaleka nie úplný zoznam) je založený na jedinečných vlastnostiach kmeňových buniek, ktoré umožňujú vytváranie nových tkanív, ktoré nahradia, ako sa predtým predpokladalo, nezvratne poškodené oblasti tkaniva chorého organizmu.

Pokrok teoretického výskumu biológie kmeňových buniek za posledných 10 rokov sa dosiahol spontánne sa rozvíjajúcimi oblasťami rozvíjajúcej sa regeneratívno-plastickej medicíny, ktorej metodológia je nielen celkom prístupná systematizácii, ale si ju aj vyžaduje. Prvou a najrýchlejšie sa rozvíjajúcou oblasťou praktického využitia regeneračného potenciálu kmeňových buniek sa stala substitučná regeneratívno-plastická terapia. Jej cesta sa dá pomerne ľahko vysledovať vo vedeckej literatúre - od experimentov na zvieratách s nekrózou myokardu až po práce posledných rokov zamerané na obnovu postinfarktového deficitu kardiomyocytov alebo doplnenie straty β-buniek pankreasu a dopaminergných neurónov centrálneho nervového systému.

Transplantácia buniek

Základom substitučnej regeneratívno-plastickej medicíny je transplantácia buniek. Tá by sa mala definovať ako komplex liečebných opatrení, počas ktorých má telo pacienta priamy kontakt s životaschopnými bunkami auto-, alo-, izo- alebo xenogénneho pôvodu počas krátkeho alebo dlhého časového obdobia. Prostriedkom transplantácie buniek je suspenzia kmeňových buniek alebo ich derivátov, štandardizovaná počtom transplantačných jednotiek. Transplantačná jednotka je pomer počtu jednotiek tvoriacich kolónie v kultúre k celkovému počtu transplantovaných buniek. Metódy transplantácie buniek: intravenózne, intraperitoneálne, subkutánne podanie suspenzie kmeňových buniek alebo ich derivátov; podanie suspenzie kmeňových buniek alebo ich derivátov do mozgových komôr, lymfatických ciev alebo mozgovomiechového moku.

Alo- a autológna transplantácia buniek využíva dva zásadne odlišné metodologické prístupy k realizácii pluri-, multi- alebo polypotentného potenciálu kmeňových buniek - in vivo alebo in vitro. V prvom prípade sa zavedenie kmeňových buniek do tela pacienta vykonáva bez ich predbežnej diferenciácie, v druhom - po reprodukcii v kultúre, cielenej diferenciácii a purifikácii od nediferencovaných prvkov. Medzi početnými metodologickými technikami substitučnej bunkovej terapie sa pomerne jasne rozlišujú tri skupiny metód: náhrada kostnej drene a krviniek, náhrada buniek orgánov a mäkkých tkanív, náhrada tuhých a pevných prvkov tela (chrupavka, kosť, šľachy, srdcové chlopne a kapacitné cievy). Druhý smer by sa mal definovať ako rekonštrukčná a regeneratívna medicína, pretože diferenciačný potenciál kmeňových buniek sa realizuje na matrici - biologicky inertnej alebo vstrebateľnej štruktúre, ktorá má tvar nahradená oblasť tela.

Ďalším spôsobom, ako zvýšiť intenzitu regeneračno-plastických procesov v poškodených tkanivách, je mobilizácia vlastných kmeňových zdrojov pacienta pomocou exogénnych rastových faktorov, ako sú faktory stimulujúce kolónie granulocytov a granulocytov a makrofágov. V tomto prípade pretrhnutie stromálnych spojení vedie k zvýšeniu uvoľňovania hematopoetických kmeňových buniek do celkového krvného obehu, ktoré v oblasti poškodenia tkaniva zabezpečujú regeneračné procesy vďaka svojej inherentnej plasticite.

Metódy regeneratívnej medicíny sú teda zamerané na stimuláciu procesov obnovy stratených funkcií - buď mobilizáciou vlastných kmeňových rezerv pacienta, alebo zavedením alogénneho bunkového materiálu.

Dôležitým praktickým výsledkom objavu embryonálnych kmeňových buniek je terapeutické klonovanie založené na pochopení spúšťačov embryogenézy. Ak je počiatočným signálom pre začiatok embryogenézy komplex pre-mRNA nachádzajúci sa v cytoplazme oocytu, potom zavedenie jadra akejkoľvek somatickej bunky do enukleovaného vajíčka by malo spustiť program vývoja embrya. Dnes už vieme, že na realizácii programu embryogenézy sa podieľa približne 15 000 génov. Čo sa s nimi deje neskôr, po narodení, počas období rastu, zrelosti a starnutia? Odpoveď na túto otázku dala ovečka Dolly: sú konzervované. Pomocou najmodernejších výskumných metód sa dokázalo, že jadrá dospelých buniek si zachovávajú všetky kódy potrebné na tvorbu embryonálnych kmeňových buniek, zárodočných vrstiev, organogenézu a reštrikčné dozrievanie (prechod na diferenciáciu a špecializáciu) bunkových línií mezenchymálneho, ekto-, endo- a mezodermálneho pôvodu. Terapeutické klonovanie ako smer sa formovalo už v najskorších štádiách vývoja bunkovej transplantológie a umožňuje návrat totipotencie k vlastným somatickým bunkám pacienta s cieľom získať geneticky identický transplantačný materiál.

Objav kmeňových buniek sa začal „od konca“, keďže termín, ktorý do biológie a medicíny zaviedol A. Maksimov, sa vzťahoval na kmeňové bunky kostnej drene, z ktorých vznikajú všetky zrelé bunkové prvky periférnej krvi. Avšak aj hematopoetické kmeňové bunky, podobne ako bunky všetkých tkanív dospelého organizmu, majú svojho vlastného, menej diferencovaného predchodcu. Spoločným zdrojom pre absolútne všetky somatické bunky je embryonálna kmeňová bunka. Treba poznamenať, že pojmy „embryonálne kmeňové bunky“ a „embryonálne kmeňové bunky“ nie sú v žiadnom prípade totožné. Embryonálne kmeňové bunky izoloval J. Thomson z vnútornej bunkovej hmoty blastocysty a preniesol ich do dlho žijúcich bunkových línií. Iba tieto bunky majú faksimile „ESC“. Leroy Stevens, ktorý objavil embryonálne kmeňové bunky v experimentoch na myšiach, ich nazval „embryonálne pluripotentné kmeňové bunky“, pričom odkazoval na schopnosť ESC diferencovať sa na deriváty všetkých troch zárodočných vrstiev (ekto-, mezo- a endoderm). Všetky bunky embrya v neskorších štádiách vývoja sú však tiež kmeňové bunky, pretože dávajú vznik obrovskému počtu buniek, ktoré tvoria telo dospelého jedinca. Na ich definovanie navrhujeme termín „embryonálne pluripotentné progenitorové bunky“.

[ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Typy kmeňových buniek

Moderná klasifikácia kmeňových buniek je založená na princípe ich delenia podľa ich schopnosti (potencie) dávať vznik bunkovým líniám, ktorá je definovaná ako toti-, pluri-, multi-, poly-, bi- a unipotentnosť. Totipotenciu, teda schopnosť znovu vytvoriť geneticky naprogramovaný organizmus ako celok, majú zygotné bunky, blastoméry a embryonálne kmeňové bunky (bunky vnútornej hmoty blastocysty). Ďalšiu skupinu totipotentných buniek, ktoré sa tvoria v neskorších štádiách embryonálneho vývoja, predstavujú primárne zárodočné bunky embryonálnej genitálnej zóny (genitálne tuberkuly). Pluripotencia, čo je schopnosť diferencovať sa na bunky akéhokoľvek orgánu alebo tkaniva, je vlastná embryonálnym bunkám troch zárodočných vrstiev - ekto-, mezo- a endodermu. Predpokladá sa, že multipotencia, teda schopnosť tvoriť akékoľvek bunky v rámci jednej špecializovanej línie, je charakteristická iba pre dva typy buniek: tzv. mezenchymálne kmeňové bunky, ktoré sa tvoria v nervovom hrebeni a sú prekurzormi všetkých buniek spojivového tkanivového základu tela vrátane neurogliových buniek, ako aj hematopoetické hematopoetické kmeňové bunky, ktoré dávajú vznik všetkým krvným bunkovým líniám. Okrem toho sa rozlišujú bi- a unipotentné kmeňové bunky, najmä prekurzorové bunky myeloidných, lymfoidných, monocytových a megakaryocytových hematopoetických klíčkov. Existencia unipotentných kmeňových buniek bola jasne dokázaná na príklade pečeňových buniek - strata významnej časti pečeňového tkaniva je kompenzovaná intenzívnym delením diferencovaných polyploidných hepatocytov.

Počas vývoja sa všetky orgány a tkanivá tvoria v dôsledku proliferácie a diferenciácie vnútornej bunkovej hmoty blastocysty, ktorej bunky sú v užšom zmysle slova totipotentné embryonálne kmeňové bunky. Prvú prácu na izolácii embryonálnych kmeňových buniek vykonal Evans, ktorý ukázal, že blastocysty implantované do mozgu myší dávajú vznik teratokarcinómom, ktorých bunky po klonovaní tvoria línie pluripotentných embryonálnych kmeňových buniek (pôvodný názov týchto buniek - embryonálne karcinómové bunky alebo v skratke ECС - sa v súčasnosti nepoužíva). Tieto údaje boli potvrdené v rade ďalších štúdií, v ktorých boli embryonálne kmeňové bunky získané kultiváciou blastocystových buniek myší a iných živočíšnych druhov, ako aj ľudí.

V posledných rokoch sa v literatúre čoraz častejšie píše o plasticite kmeňových buniek, ktorá sa nepovažuje len za schopnosť kmeňových buniek diferencovať sa na rôzne typy buniek v rôznych štádiách vývoja, ale aj za ich dediferenciáciu (transdiferenciáciu, retrodiferenciáciu). To znamená, že sa pripúšťa zásadná možnosť návratu somatickej diferencovanej bunky do štádia embryonálneho vývoja s rekapituláciou (návratom) pluripotencie a jej realizáciou v opakovanej diferenciácii s tvorbou buniek iného typu. Konkrétne sa uvádza, že hematopoetické kmeňové bunky sú schopné transdiferenciácie s tvorbou hepatocytov, kardiomyoblastov a endotelocytov.

Vedecké diskusie týkajúce sa delenia kmeňových buniek podľa ich plasticity pokračujú, to znamená, že terminológia a glosár bunkovej transplantácie sú v procese formovania, čo má priamy praktický význam, pretože väčšina metód regeneratívnej plastickej medicíny je založená na využití plastických vlastností a schopnosti kmeňových buniek diferencovať sa na rôzne bunkové línie.

Počet publikácií v oblasti základných a aplikovaných problémov regeneratívno-plastickej medicíny rýchlo rastie. Už bola načrtnutá škála rôznych metodologických prístupov zameraných na čo najoptimálnejšie využitie regeneratívno-plastického potenciálu kmeňových buniek. Kardiológovia a endokrinológovia, neurológovia a neurochirurgovia, transplantológovia a hematológovia identifikovali oblasti svojho naliehavého záujmu. Oftalmológovia, ftizeológovia, pulmonológovia, nefrológovia, onkológovia, genetici, pediatri, gastroenterológovia, terapeuti a pediatri, chirurgovia a pôrodníci-gynekológovia hľadajú riešenie naliehavých problémov v plastických schopnostiach kmeňových buniek - všetci predstavitelia modernej medicíny dúfajú, že dostanú príležitosť liečiť choroby, ktoré boli predtým považované za smrteľné.

Je transplantácia buniek ďalším „všeliek“?

Táto otázka celkom oprávnene vyvstáva u všetkých premýšľavých lekárov a vedcov, ktorí analyzujú súčasný stav lekárskej vedy. Situáciu komplikuje fakt, že na jednej strane vedeckej konfrontácie sú „zdraví konzervatívci“, na druhej strane – „chorí fanatici“ bunkovej transplantológie. Pravda je, ako vždy, medzi nimi – v „zemi nikoho“. Bez toho, aby sme sa dotýkali otázok práva, etiky, náboženstva a morálky, zvážme výhody a nevýhody určených oblastí regeneratívno-plastickej medicíny. „Ľahký vánok“ prvých vedeckých správ o terapeutických možnostiach embryonálnych kmeňových buniek sa rok po ich objavení zmenil na „prudký vietor“, ktorý sa v roku 2003 rozvíril do „informačného tornáda“. Prvá séria publikácií sa zaoberala otázkami kultivácie embryonálnych kmeňových buniek, ich reprodukcie a riadenej diferenciácie in vitro.

Ukázalo sa, že pre neobmedzenú reprodukciu embryonálnych kmeňových buniek v kultúre je potrebné prísne dodržiavať niekoľko podmienok. V podmienenom médiu musia byť prítomné tri faktory: interleukín-6 (IL-6), faktor kmeňových buniek (SCF) a faktor inhibujúci leukázu (LIF). Okrem toho musia byť embryonálne kmeňové bunky pestované na substráte (kŕmnej vrstve buniek) embryonálnych fibroblastov a v prítomnosti fetálneho teľacieho séra. Ak sú tieto podmienky splnené, ESC v kultúre rastú ako klony a tvoria embryoidné telieska - agregáty suspenzných klonov sférických buniek. Najdôležitejšou vlastnosťou klonu ESC je, že v kultúre embryoidné telo prestane rásť, keď sa v agregáte nahromadí 50-60, maximálne 100 buniek. Počas tohto obdobia nastáva rovnovážny stav - rýchlosť bunkového delenia vo vnútri klonu sa rovná rýchlosti apoptózy (programovanej bunkovej smrti) na jeho periférii. Po dosiahnutí takejto dynamickej rovnováhy periférne bunky embryoidného tela podliehajú spontánnej diferenciácii (zvyčajne s tvorbou endodermálnych fragmentov žĺtkového vaku, angioblastov a endotelocytov) so stratou totipotencie. Preto, aby sa získalo dostatočné množstvo totipotentnej bunkovej hmoty, musí sa embryoidné telo týždenne rozdeľovať transplantáciou jednotlivých embryonálnych kmeňových buniek do nového živného média - čo je pomerne prácny proces.

Objav embryonálnych kmeňových buniek neodpovedal na otázku, čo presne a ako spúšťa programy embryogenézy zašifrované v DNA zygoty. Zostáva nejasné, ako sa genómový program odvíja počas ľudského života. Zároveň štúdium embryonálnych kmeňových buniek umožnilo vyvinúť koncept mechanizmov na udržanie toti-, pluri- a multipotencie kmeňových buniek počas ich delenia. Hlavným rozlišovacím znakom kmeňovej bunky je jej schopnosť samoreprodukcie. To znamená, že kmeňová bunka sa na rozdiel od diferencovanej bunky delí asymetricky: jedna z dcérskych buniek dáva vznik špecializovanej bunkovej línii a druhá si zachováva toti-, pluri- alebo multipotenciu genómu. Zostáva nejasné, prečo a ako k tomuto procesu dochádza v najskorších štádiách embryogenézy, keď je deliaca sa vnútorná bunková hmota blastocysty úplne totipotentná a genóm ESC je v dormantnom (spiacom, inhibovanom) stave. Ak počas delenia bežnej bunky procesu duplikácie nevyhnutne predchádza aktivácia a expresia celého komplexu génov, potom počas delenia ESC sa tak nedeje. Odpoveď na otázku „prečo“ bola získaná po objavení už existujúcej mRNA (pre-mRNA) v ESC, z ktorých niektoré sa tvoria vo folikulárnych bunkách a sú uložené v cytoplazme vajíčka a zygoty. Druhý objav odpovedal na otázku „ako“: v ESC boli nájdené špeciálne enzýmy nazývané „editázy“. Editázy plnia tri dôležité funkcie. Po prvé, zabezpečujú alternatívne epigenetické (bez účasti genómu) čítanie a duplikáciu pre-mRNA. Po druhé, implementujú proces aktivácie pre-mRNA (zostrih - vystrihnutie intrónov, teda neaktívnych úsekov RNA, ktoré inhibujú proces syntézy bielkovín na mRNA), po ktorom sa v bunke začína zostavovanie bielkovinových molekúl. Po tretie, editázy podporujú tvorbu sekundárnych mRNA, ktoré sú represormi mechanizmov génovej expresie, čím sa udržiava husté balenie chromatínu a neaktívny stav génov. Bielkovinové produkty syntetizované na takýchto sekundárnych mRNA a nazývané silencer proteíny alebo strážcovia genómu, sú prítomné v ľudských vajíčkach.

Takto sa dnes prezentuje mechanizmus tvorby nesmrteľných bunkových línií embryonálnych kmeňových buniek. Zjednodušene povedané, signál na spustenie programu embryogenézy, ktorého počiatočné fázy pozostávajú z tvorby totipotentnej bunkovej hmoty, pochádza z cytoplazmy vajíčka. Ak sa v tomto štádiu vnútorná bunková hmota blastocysty, teda ESC, izoluje od ďalších regulačných signálov, proces samoreprodukcie buniek prebieha v uzavretom cykle bez účasti génov bunkového jadra (epigeneticky). Ak je takáto bunka zabezpečená živným materiálom a izolovaná od vonkajších signálov, ktoré podporujú diferenciáciu bunkovej hmoty, bude sa deliť a reprodukovať svoj vlastný druh donekonečna.

Prvé výsledky experimentálnych pokusov o použitie totipotentných buniek na transplantáciu boli pomerne pôsobivé: zavedenie embryonálnych kmeňových buniek do tkanív myší s imunitným systémom oslabeným imunosupresívami viedlo k vzniku nádorov v 100 % prípadov. Medzi bunkami neoplazmy, ktorých zdrojom boli embryonálne kmeňové bunky (ESC), sa nachádzali diferencované deriváty totipotentného exogénneho bunkového materiálu, najmä neuróny, ale rast teratokarcinómov znížil hodnotu získaných výsledkov na nulu. Zároveň v prácach L. Stevensa ESC zavedené do brušnej dutiny tvorili veľké agregáty, v ktorých sa fragmentárne formovali embryonálne svaly, srdce, vlasy, koža, kosti, svaly a nervové tkanivo. (Chirurgovia, ktorí otvárali dermoidné cysty, by mali byť s týmto obrázkom oboznámení). Je zaujímavé, že suspendované myšie embryonálne bunky sa správajú úplne rovnako: ich zavedenie do tkanív dospelých zvierat s oslabenou imunitou vždy spôsobuje vznik teratokarcinómov. Ak sa však z takéhoto nádoru izoluje čistá línia ESC a zavedie sa do brušnej dutiny, opäť sa vytvoria špecializované somatické deriváty všetkých troch zárodočných vrstiev bez známok karcinogenézy.

Ďalším problémom, ktorý bolo potrebné vyriešiť, bolo teda čistenie bunkového materiálu od nečistôt nediferencovaných buniek. Avšak aj pri veľmi vysokej účinnosti cielenej bunkovej diferenciácie si až 20 % buniek v kultúre zachováva svoj totipotentný potenciál, ktorý sa in vivo, žiaľ, realizuje pri raste nádoru. Ďalší „prak“ prírody – na škále medicínskeho rizika sa záruka uzdravenia pacienta vyvažuje so zárukou jeho smrti.

Vzťah medzi nádorovými bunkami a embryonálnymi pluripotentnými progenitorovými bunkami (EPPC), ktoré sú vo vývoji pokročilejšie ako ESC, je pomerne nejednoznačný. Výsledky našich štúdií ukázali, že zavedenie EPPC do rôznych transplantovateľných nádorov u potkanov môže viesť k rozpadu nádorového tkaniva (G), rýchlemu zvýšeniu hmoty nádoru (D), jeho redukcii (E-3) alebo neovplyvňuje veľkosť spontánnej centrálnej fokálnej nekrózy neoplastického tkaniva (I, K). Je zrejmé, že výsledok interakcie EPPC a nádorových buniek je určený celkovým súborom cytokínov a rastových faktorov, ktoré produkujú in vivo.

Je pozoruhodné, že embryonálne kmeňové bunky, ktoré reagujú karcinogenézou na kontakt s dospelými tkanivami, sa dokonale asimilujú s bunkovou hmotou embrya a integrujú sa do všetkých orgánov embrya. Takéto chiméry, pozostávajúce z vlastných buniek embrya a darcovských ESC, sa nazývajú alofénové zvieratá, hoci v skutočnosti nejde o fenotypové chiméry. Hematopoetický systém, koža, nervové tkanivo, pečeň a tenké črevo prechádzajú maximálnou bunkovou chimerizáciou, keď sú ESC zavedené do skorého embrya. Boli opísané prípady chimerizácie genitálií. Jedinou nedotknuteľnou zónou pre ESC sú primárne zárodočné bunky.

To znamená, že embryo si zachováva genetickú informáciu svojich rodičov, čo chráni čistotu a pokračovanie rodu aj druhu.

Za podmienok blokády bunkového delenia raného embrya pomocou cytoklazínu vedie zavedenie embryonálnych kmeňových buniek do blastocysty k vývoju embrya, ktorého primárne zárodočné bunky, rovnako ako všetky ostatné, boli vytvorené z darcovských embryonálnych kmeňových buniek. V tomto prípade je však samotné embryo úplne darcovské, geneticky cudzie telu náhradnej matky. Mechanizmy takéhoto prirodzeného blokovania potenciálu miešania vlastných a cudzích dedičných informácií ešte neboli objasnené. Dá sa predpokladať, že v tomto prípade sa realizuje program apoptózy, ktorého determinanty nám ešte nie sú známe.

Treba poznamenať, že embryogenéza zvierat rôznych druhov nie je nikdy koordinovaná: pri implementácii darcovského programu organogenézy v tele recipientného embrya xenogénnych embryonálnych kmeňových buniek embryo umiera in utero a resorbuje sa. Preto by sa existencia chimér „potkan-myš“, „prasa-krava“, „človek-potkan“ mala chápať ako bunková, ale nie morfologická mozaika. Inými slovami, keď sú ESC jedného druhu cicavca zavedené do blastocysty iného druhu, vždy sa vyvinú potomkovia materského druhu, v ktorých sa medzi vlastnými bunkami takmer všetkých orgánov nachádzajú inklúzie a niekedy aj zhluky štrukturálnych a funkčných jednotiek pozostávajúcich z geneticky cudzieho materiálu derivátov ESC. Pojem „humanizovaná prasa“ nemožno vnímať ako označenie nejakého druhu monštra obdareného inteligenciou alebo vonkajšími vlastnosťami človeka. Ide len o zviera, ktorého časť telesných buniek pochádza z ľudských ESC zavedených do blastocysty prasaťa.

Perspektívy využitia kmeňových buniek

Dlhodobo je známe, že ochorenia spojené s genopatológiou buniek hematopoetickej a lymfoidnej línie sú po alogénnej transplantácii kostnej drene často eliminované. Nahradenie vlastného hematopoetického tkaniva geneticky normálnymi bunkami od príbuzného darcu vedie k čiastočnému a niekedy úplnému uzdraveniu pacienta. Medzi genetickými ochoreniami, ktoré sa liečia alogénnou transplantáciou kostnej drene, stojí za zmienku syndróm kombinovanej imunodeficiencie, X-viazaná agamaglobulinémia, chronická granulomatóza, Wiskott-Aldrichov syndróm, Gaucherova a Hurlerova choroba, adrenoleukodystrofia, metachromatická leukodystrofia, kosáčikovitá anémia, talasémia, Fanconiho anémia a AIDS. Hlavný problém pri použití alogénnej transplantácie kostnej drene pri liečbe týchto ochorení je spojený s výberom HbA-kompatibilného príbuzného darcu, na ktorého úspešné vyhľadávanie je potrebných v priemere 100 000 vzoriek typovaného hematopoetického tkaniva darcu.

Génová terapia umožňuje korekciu genetickej poruchy priamo v hematopoetických kmeňových bunkách pacienta. Teoreticky génová terapia poskytuje rovnaké výhody pri liečbe genetických ochorení hematopoetického systému ako alogénna transplantácia kostnej drene, ale bez všetkých možných imunologických komplikácií. Vyžaduje si to však techniku, ktorá umožňuje efektívny prenos plnohodnotného génu do hematopoetických kmeňových buniek a udržiavanie požadovanej úrovne jeho expresie, ktorá pri určitých typoch dedičnej patológie nemusí byť veľmi vysoká. V tomto prípade aj mierne doplnenie proteínového produktu deficitného génu prináša pozitívny klinický účinok. Najmä pri hemofílii B je 10 – 20 % normálnej hladiny faktora IX úplne postačujúce na obnovenie vnútorného mechanizmu zrážania krvi. Genetická modifikácia autológneho bunkového materiálu sa osvedčila pri experimentálnom hemiparkinsonizme (jednostranná deštrukcia dopaminergných neurónov). Transfekcia embryonálnych fibroblastov potkanov retrovírusovým vektorom obsahujúcim gén tyrozínhydroxylázy zabezpečila syntézu dopamínu v centrálnom nervovom systéme: intracerebrálne podanie transfekovaných fibroblastov výrazne znížilo intenzitu klinických prejavov experimentálneho modelu Parkinsonovej choroby u experimentálnych zvierat.

Perspektíva využitia kmeňových buniek na génovú terapiu ľudských ochorení predstavuje pre klinických lekárov a experimentátorov mnoho nových výziev. Problematické aspekty génovej terapie sú spojené s vývojom bezpečného a účinného systému pre transport génov do cieľovej bunky. V súčasnosti je účinnosť prenosu génov do veľkých cicavčích buniek veľmi nízka (1 %). Metodicky sa tento problém rieši rôznymi spôsobmi. Prenos génov in vitro zahŕňa transfekciu genetického materiálu do pacientových buniek v kultúre s ich následným návratom do tela pacienta. Tento prístup by mal byť uznaný za optimálny pri použití génov zavedených do kmeňových buniek kostnej drene, pretože metódy prenosu hematopoetických buniek z tela do kultúry a späť sú dobre zavedené. Retrovírusy sa najčastejšie používajú na prenos génov do hematopoetických buniek in vitro. Väčšina hematopoetických kmeňových buniek je však v dormantnom stave, čo komplikuje transport genetickej informácie pomocou retrovírusov a vyžaduje si hľadanie nových spôsobov účinného transportu génov do dormantných kmeňových buniek. V súčasnosti sa používajú metódy prenosu génov, ako je transfekcia, priama mikroinjekcia DNA do buniek, lipofekcia, elektroporácia, „génová pištoľ“, mechanické spájanie pomocou sklenených guľôčok, transfekcia hepatocytov s receptorovo závislou väzbou DNA na asialoglykoproteín a aerosólové zavedenie transgénu do buniek alveolárneho epitelu pľúc. Účinnosť prenosu DNA týmito metódami je 10,0 – 0,01 %. Inými slovami, v závislosti od spôsobu zavedenia genetickej informácie možno očakávať úspech u 10 pacientov zo 100 alebo u 1 pacienta z 10 000 pacientov. Je zrejmé, že účinná a zároveň bezpečná metóda prenosu terapeutických génov ešte nebola vyvinutá.

Zásadne odlišným riešením problému odmietnutia alogénneho bunkového materiálu v bunkovej transplantológii je použitie vysokých dávok embryonálnych pluripotentných progenitorových buniek na dosiahnutie efektu reinštalácie systému kontroly antigénovej homeostázy dospelého organizmu (efekt Kukharčuka-Radčenka-Sirmana), ktorého podstata spočíva v indukcii imunologickej tolerancie vytvorením novej základne imunokompetentných buniek so súčasným preprogramovaním systému kontroly antigénovej homeostázy. Po zavedení vysokých dávok EPPC sa tieto fixujú v tkanivách týmusu a kostnej drene. V týmuse sa EPPC pod vplyvom špecifického mikroprostredia diferencujú na dendritické, interdigitálne bunky a epitelovo-stromálne elementy. Počas diferenciácie EPPC v týmuse príjemcu sa spolu s vlastnými molekulami hlavného histokompatibilného komplexu (MHC) príjemcu exprimujú aj molekuly MHC, ktoré sú geneticky určené v darcovských bunkách, teda vzniká dvojitý štandard molekúl MHC, podľa ktorého sa realizuje pozitívna a negatívna selekcia T-lymfocytov.

Obnova efektorového článku imunitného systému príjemcu teda prebieha prostredníctvom známych mechanizmov pozitívnej a negatívnej selekcie T-lymfocytov, ale prostredníctvom dvojitého štandardu molekúl MHC - EPPC príjemcu a darcu.

Reprogramovanie imunitného systému pomocou EPPC nielenže umožňuje transplantáciu buniek bez následného dlhodobého užívania imunosupresív, ale otvára aj úplne nové perspektívy v liečbe autoimunitných ochorení a poskytuje základ pre rozvoj nových myšlienok o procese starnutia človeka. Pre pochopenie mechanizmov starnutia sme navrhli teóriu vyčerpania kmeňových priestorov tela. Podľa hlavného ustanovenia tejto teórie je starnutie trvalé zmenšenie veľkosti kmeňových priestorov tela, ktoré sa chápu ako zásoba regionálnych („dospelých“) kmeňových buniek (mezenchymálne, neuronálne, hematopoetické kmeňové bunky, progenitorové bunky kože, tráviaceho traktu, endokrinného epitelu, pigmentové bunky ciliárnych záhybov atď.), dopĺňajúce bunkové straty zodpovedajúceho tkaniva v procese remodelácie tela. Remodelácia tela je obnova bunkového zloženia všetkých tkanív a orgánov vďaka bunkám kmeňových priestorov, ktorá pokračuje počas celého života mnohobunkového organizmu. Počet buniek v kmeňových priestoroch je určený geneticky, čo určuje obmedzenú veľkosť (proliferačný potenciál) každého kmeňového priestoru. Veľkosť kmeňových priestorov zase určuje rýchlosť starnutia jednotlivých orgánov, tkanív a telesných systémov. Po vyčerpaní bunkových rezerv kmeňových priestorov je intenzita a rýchlosť starnutia mnohobunkového organizmu určená mechanizmami starnutia somatických diferencovaných buniek v rámci Hayflickovho limitu.

Preto v štádiu postnatálnej ontogenézy môže rozšírenie kmeňových priestorov nielen výrazne predĺžiť životnosť, ale aj zlepšiť kvalitu života obnovením remodelačného potenciálu tela. Rozšírenie kmeňových priestorov možno dosiahnuť zavedením veľkých dávok alogénnych embryonálnych pluripotentných progenitorových buniek za predpokladu, že imunitný systém príjemcu je súčasne preprogramovaný, čo významne zvyšuje životnosť starých myší v experimente.

Teória deplécie kmeňových priestorov môže zmeniť existujúce predstavy nielen o mechanizmoch starnutia, ale aj o samotnom ochorení, ako aj o dôsledkoch jeho medikamentóznej liečby. Ochorenie sa môže vyvinúť najmä v dôsledku patológie buniek kmeňových priestorov (onkopatológia). Deplécia rezervy mezenchymálnych kmeňových buniek narúša procesy prestavby spojivového tkaniva, čo vedie k objaveniu sa vonkajších znakov starnutia (vrásky, ochabnutosť kože, celulitída). Deplécia rezervy kmeňových endotelových buniek spôsobuje rozvoj arteriálnej hypertenzie a aterosklerózy. Spočiatku malá veľkosť kmeňového priestoru týmusu určuje jeho skorú trvalú vekom podmienenú involúciu. Predčasné starnutie je dôsledkom počiatočného patologického zmenšenia veľkosti všetkých kmeňových priestorov tela. Stimulácia rezerv kmeňových buniek liekmi a neliečivami zlepšuje kvalitu života skracovaním jeho trvania, pretože znižuje veľkosť kmeňových priestorov. Nízka účinnosť moderných geroprotektorov je spôsobená ich ochranným účinkom na starnúce diferencované somatické bunky, a nie na kmeňové priestory tela.

Na záver by sme chceli ešte raz poznamenať, že regeneratívno-plastická medicína je nový smer v liečbe ľudských ochorení založený na využití regeneratívno-plastického potenciálu kmeňových buniek. V tomto prípade sa plasticita chápe ako schopnosť exogénnych alebo endogénnych kmeňových buniek implantovať sa a viesť k vzniku nových špecializovaných bunkových klíčkov v poškodených oblastiach tkaniva chorého organizmu. Predmetom regeneratívno-plastickej medicíny sú smrteľné ľudské ochorenia, ktoré sú v súčasnosti nevyliečiteľné, dedičná patológia, ochorenia, pri ktorých metódy tradičnej medicíny dosahujú iba symptomatický účinok, ako aj anatomické defekty tela, ktorých obnova je cieľom rekonštrukčno-plastickej regeneračnej chirurgie. Podľa nášho názoru je priskoro považovať prvé pokusy o znovuvytvorenie celých a funkčne kompletných orgánov z kmeňových buniek za samostatnú oblasť praktickej medicíny. Predmetom regeneratívno-plastickej medicíny sú kmeňové bunky, ktoré majú v závislosti od zdroja ich príjmu rôzny regeneratívno-plastický potenciál. Metodika regeneratívno-plastickej medicíny je založená na transplantácii kmeňových buniek alebo ich derivátov.