Krvotvorné kmeňové bunky z pupočníkovej krvi

Pupočníková krv je dobrým zdrojom hematopoetických kmeňových buniek z hľadiska proliferačného potenciálu a repopulačných schopností hematopoetických buniek. Opakovane sa preukázalo, že v čase narodenia obsahuje pupočníková krv dostatočne veľký počet slabo viazaných hematopoetických progenitorových buniek. Niektorí autori sa domnievajú, že výhodou transplantácie hematopoetických kmeňových buniek z pupočníkovej krvi je absencia potreby hľadať darcu kompatibilného s HLA antigénmi. Podľa ich názoru nezrelosť imunitného systému novorodenca spôsobuje zníženú funkčnú aktivitu imunokompetentných buniek, a teda nižší výskyt závažnej reakcie štepu proti hostiteľovi (GVC) ako pri transplantácii kostnej drene. Zároveň miera prežitia transplantovaných buniek z pupočníkovej krvi nie je nižšia ako miera prežitia buniek kostnej drene, a to ani v prípade použitia menšieho počtu HSC podávaných na 1 kg telesnej hmotnosti pacienta. Podľa nášho názoru si však otázky optimálneho počtu transplantovaných buniek pupočníkovej krvi potrebných na efektívne uchytenie v tele príjemcu, ich imunologická kompatibilita a množstvo ďalších aspektov problému transplantácie hematopoetických kmeňových buniek pupočníkovej krvi vyžadujú serióznejšiu analýzu.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Získanie hematopoetických kmeňových buniek z pupočníkovej krvi

Postup získavania hematopoetických kmeňových buniek z pupočníkovej krvi vyžaduje jej odber bezprostredne po narodení dieťaťa a ich oddelenie od placenty, keď je placenta in utero alebo ex utero, ako aj počas cisárskeho rezu, ale aj ex utero. Bolo preukázané, že ak sa čas od okamihu narodenia do oddelenia novorodenca od placenty skráti na 30 sekúnd, objem získanej pupočníkovej krvi sa zvýši v priemere o 25 – 40 ml. Ak sa tento postup vykoná neskôr, stratí sa rovnaké množstvo krvi. Bolo zistené, že skoré oddelenie dieťaťa od placenty nemá pre novorodenca žiadne negatívne následky.

Ruský výskumný ústav hematológie a transfuziológie vyvinul účinné a nízkonákladové technológie na získavanie pupočníkovej krvi počas normálneho pôrodu ((70,2+25,8) ml) aj cisárskeho rezu ((73,4+25,1) ml). Bola navrhnutá metóda separácie pupočníkovej krvi s dostatočne vysokým výťažkom jadrových a mononukleárnych buniek - (83,1+9,6) a (83,4+14,1) %. Bola vylepšená metóda kryokonzervácie pupočníkovej krvi, ktorá zabezpečuje vysokú konzerváciu mononukleárnych buniek a CFU-GM - (96,8+5,7) a (89,6+22,6) %. Bola stanovená účinnosť drenážnej metódy na odber pupočníkovej krvi pomocou nádoby Kompoplast-300 (Rusko). Autori odobrali pupočníkovú krv bezprostredne po narodení dieťaťa a jeho oddelení od placenty, za podmienok umiestnenia placenty in utero alebo ex utero. Pred punkciou pupočnej žily bola pupočná šnúra raz ošetrená 5 % jódovou tinktúrou a potom dvakrát 70 % etylalkoholom. Krv spontánne tiekla cez spojovacie hadičky do nádoby. Odber netrval dlhšie ako 10 minút. Priemerný objem 66 vzoriek pupočníkovej krvi odobratých drenážou bol (72 + 28) ml a počet leukocytov v priemernom celkovom objeme vzorky bol (1,1 + 0,6) x 107. Pri analýze pupočníkovej krvi na sterilitu (bakteriálna kontaminácia, HIV-1, vírusy hepatitídy B a C, syfilis a cytomegalovírusová infekcia) boli protilátky IgG proti vírusu hepatitídy C zistené iba v jednej vzorke. V inej štúdii bola placenta ihneď po narodení umiestnená fetálnou plochou nadol na špeciálny rám, pupočná šnúra bola ošetrená 5 % roztokom jódu a 75 % etylalkoholom. Pupočná žila bola drenovaná pomocou ihly z transfúzneho systému (G16). Krv tiekla do nádoby spontánne. Priemerný objem takto odobratej krvi bol (55 + 25) ml. V práci G. Koglera a kol. (1996) bola pupočná krv odobratá uzavretou metódou a boli získané veľké objemy krvi - v priemere (79+26) ml. Autori poznamenávajú, že spomedzi 574 vzoriek pupočníkovej krvi obsahovalo približne 7 % menej ako 40 ml krvi, čo neumožňuje ich použitie na transplantáciu. K. Isoyama a kol. (1996) pri odbere pupočníkovej krvi aktívnou exfúziou pomocou striekačiek získali v priemere 69,1 ml krvi (objem pupočníkovej krvi sa pohyboval od 15 do 135 ml). Nakoniec sa A. Abdel-Mageed PI a kol. (1997) podarilo získať v priemere 94 ml pupočníkovej krvi (od 56 do 143 ml) katetrizáciou pupočníkovej žily.

Na zníženie rizika iatrogénnej infekcie a kontaminácie materskými sekrétmi bol vyvinutý uzavretý systém odberu krvi, založený na široko používanom transfúznom systéme spoločnosti Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL (USA), ktorý obsahuje 62,5 ml CPDA (citrát-fosfát-dextróza s adenínom) ako antikoagulancium. Technológia získavania materiálu má prvoradý význam pre prípravu vysokokvalitnej vzorky z hľadiska objemu, obsahu a čistoty bunkovej suspenzie. Z existujúcich metód odberu pupočníkovej krvi, ktoré sa konvenčne klasifikujú na uzavreté, polootvorené a otvorené systémy, by sa mala uprednostniť prvá, pretože uzavretý systém výrazne znižuje riziko mikrobiálnej kontaminácie materiálu, ako aj kontaminácie bunkovej suspenzie materskými bunkami.

A. Nagler a kol. (1998) vykonali porovnávaciu analýzu účinnosti všetkých troch systémov na odber pupočníkovej krvi. V prvom variante sa postup uskutočnil v uzavretom systéme exfoliáciou krvi priamo do nádoby. V druhom variante sa pupočníková krv získala aktívnou exfúziou krvi pomocou striekačky MP1 s následným prepláchnutím placentárnych žíl a súčasným odtokom krvi do nádoby (otvorená metóda). V treťom variante sa krv odoberala v polootvorenom systéme aktívnym odberom pomocou striekačiek a prepláchnutím cez pupočníkovú tepnu so súčasnou exfúziou do nádoby. V prvom variante autori získali pupočníkovú krv v objeme (76,4+32,1) ml s obsahom leukocytov (10,5+3,6) x 106 ^v 1 ml krvi. V druhom variante boli zodpovedajúce ukazovatele (174,4+42,8) ml a (8,8+3,4) x 106 ^/ ml; v treťom - (173,7+41,3) ml a (9,3+3,8) x 106 ^/ ml. Najčastejšia infekcia vzoriek pupočníkovej krvi bola pozorovaná pri použití otvoreného systému. Bola stanovená priama korelácia medzi hmotnosťou placenty a objemom odobratej krvi - so zvyšujúcou sa hmotnosťou placenty sa zvyšuje množstvo odobratej krvi.

Po odbere pupočníkovej krvi nasleduje fáza separácie - izolácia mononukleárnych buniek a čistenie bunkovej suspenzie z erytrocytov. V experimentálnych podmienkach sa jadrové bunky izolujú sedimentáciou s metylcelulózou počas lýzy erytrocytov chloridom amónnym. Metylcelulóza by sa však nemala používať na klinické účely, pretože straty hematopoetických kmeňových buniek na nej dosahujú 50 – 90 %. Lýza erytrocytov sa v klinickej praxi tiež takmer nikdy nevykonáva kvôli veľkým objemom pracovného roztoku, hoci percento izolácie jadrových buniek s fenotypom CD34+, ako aj progenitorových buniek s funkciami CFU-GM a CFU-GEMM týmto spôsobom je výrazne vyššie. Uvádza sa vznik nového prostriedku na izoláciu mononukleárnych buniek v hustotnom gradiente, roztoku buyant density (BDS72). Táto látka má nasledujúce fyziologické parametre: pH – 7,4, osmolalita – 280 mOsm/kg, hustota – 1,0720 g/ml. Podľa autorov sa dá použiť na izoláciu až 100 % CD34-pozitívnych buniek a odstránenie 98 % erytrocytov. BDS72 sa však v klinickej praxi zatiaľ nepoužíva.

V schválených metódach izolácie jadrových buniek z pupočníkovej krvi sa zvyčajne používa 10 % roztok hydroxyetylškrobu alebo 3 % roztok želatíny. Účinnosť sedimentácie erytrocytov a izolácie jadrových buniek je v oboch prípadoch približne rovnaká. Avšak pri použití želatíny ako sedimentačného činidla je možné získať o niečo väčšie množstvo CFU-GM ako pri použití hydroxyetylškrobu. Predpokladá sa, že rozdiely v účinnosti izolácie CFU-GM sú spôsobené rôznymi rýchlosťami sedimentácie jednotlivých frakcií jadrových buniek alebo schopnosťou molekúl hydroxyetylškrobu absorbovať sa na povrchu receptorov hematopoetických buniek a tým blokovať ich citlivosť na faktory stimulujúce kolónie používané pri kultivácii CFU-GM in vitro. Napriek tomu môžu byť oba sedimentátory vhodné na izoláciu jadrových buniek pri vytváraní rozsiahlych bánk pupočníkovej krvi.

Metódy separácie a kryokonzervácie pupočníkovej krvi sa v podstate nelíšia od metód používaných pri práci s hematopoetickými kmeňovými bunkami periférnej krvi a kostnej drene dospelých darcov. Pri príprave veľkého množstva vzoriek pupočníkovej krvi pre jej banky však musia byť metódy separácie v prvom rade nízkonákladové. Preto sa v súčasnosti, žiaľ, pre klinické potreby používajú už overené rutinné metódy izolácie a kryokonzervácie buniek pupočníkovej krvi a experimentátorom zostávajú účinnejšie, ale nákladnejšie metódy.

Vo všeobecnosti boli schválené kritériá na posudzovanie počtu hematopoetických buniek a požiadavky na vyšetrenie vzoriek pupočníkovej krvi na identifikáciu infekčných agensov. Aby sa zabezpečila bezpečnosť transplantácie hematopoetických buniek z pupočníkovej krvi, všetky vzorky krvi musia byť vyšetrené predovšetkým na hematogénne prenosné infekcie a genetické ochorenia. Viacerí autori odporúčajú ďalšie špeciálne metódy vyšetrenia pupočníkovej krvi na diagnostiku genetických ochorení, ako je a-talasémia, kosáčikovitá anémia, deficit adenozíndeaminázy, Brutonova agamaglobulinémia, Hurlerova a Ponterova choroba.

Podľa odporúčaní L. Ticheliho a spoluautorov (1998) sa každá vzorka pupočníkovej krvi musí testovať na nukleované bunky, CD34-pozitívne bunky a CFU-GM, musí sa vykonať HLA typizácia a určiť krvnú skupinu podľa ABO a jej Rh faktora. Okrem toho sa musí vykonať bakteriologická kultivácia, sérologické testovanie na HIV a cytomegalovírusovú infekciu, HBsAg, vírusovú hepatitídu C, HTLY-I a HTLV-II (ľudská T-bunková leukémia), syfilis a toxoplazmózu. Polymerázová reťazová reakcia na cytomegalovírus a HIV infekciu je povinná.

Postup odberu pupočníkovej krvi sa musí vykonávať v prísnom súlade so zásadami lekárskej bioetiky. Pred odberom krvi je potrebné získať súhlas tehotnej ženy. Predbežný rozhovor s tehotnou ženou za účelom získania informovaného súhlasu so všetkými manipuláciami, od odberu krvi až po vyplnenie dokumentácie, vykonávajú iba zdravotnícki pracovníci. V žiadnom prípade nie je prípustné, aby ktorýkoľvek z týchto postupov vykonával personál s biologickým, chemickým, farmaceutickým alebo iným nemedicínskym vzdelaním, z dôvodu porušenia zavedených noriem bioetiky a ľudských práv. V prípade pozitívnych testov na nosičstvo HBsAg, prítomnosti protilátok proti patogénom hepatitídy C, HIV infekcie a syfilisu sa pupočníková krv neodoberá a vzorky už odobratej krvi sa odmietajú a zničia. Treba poznamenať, že nosičstvo latentných infekcií u novorodencov je oveľa menej časté ako u dospelých, preto je pravdepodobnosť hematogénneho prenosu a vzniku infekčných komplikácií počas infúzií hematopoetických buniek z pupočníkovej krvi výrazne nižšia ako v prípade použitia kostnej drene dospelého darcu na transplantáciu.

Dôležitým aspektom klinického využitia pupočníkovej krvi je hodnotenie transplantácie, ktoré je založené na určení množstva hematopoetických kmeňových buniek vo vzorke pupočníkovej krvi a dávok buniek potrebných na transplantáciu. V súčasnosti ešte neboli vyvinuté štandardy pre optimálne množstvo buniek pupočníkovej krvi potrebných na transplantáciu. Neexistuje všeobecne akceptovaný názor ani na také rutinné parametre, ako je počet CD34-pozitívnych buniek a CFU-GM. Niektorí autori hodnotia potenciál hematopoetických buniek analýzou dlhodobých kultúr so stanovením obsahu jednotiek tvoriacich kolónie spoločných pre granulocyty, erytrocyty, monocyty a megakaryocyty - CFU-GEMM.

V klinickom prostredí však štandardné hodnotenie transplantácie pupočníkovej krvi zvyčajne zahŕňa iba stanovenie počtu jadrových alebo mononukleárnych buniek.

Uskladnenie hematopoetických kmeňových buniek z pupočníkovej krvi

V technológii skladovania hematopoetických buniek pupočníkovej krvi existujú aj určité problémy. Pri kryokonzervácii hematopoetických kmeňových buniek je potrebné na dosiahnutie optimálneho režimu mrazenia čo najviac znížiť objem pupočníkovej krvi a tiež vopred odstrániť erytrocyty, aby sa predišlo hemolýze a riziku vzniku reakcie nekompatibility s erytrocytovými antigénmi (ABO, Rh). Na tieto účely sú vhodné rôzne metódy izolácie jadrových buniek. Začiatkom 90. rokov minulého storočia bola najpoužívanejšou metódou izolácia jadrových buniek v hustotnom gradiente na báze Ficollu s hustotou 1,077 g/ml alebo Percollu s hustotou 1,080 g/ml. Separácia pupočníkovej krvi v hustotnom gradiente umožňuje izoláciu prevažne mononukleárnych buniek, ale vedie k významným stratám hematopoetických progenitorových buniek - až 30-50%.

Sedimentačná účinnosť hydroxyetylškrobu v procese izolácie krvotvorných buniek z pupočníkovej krvi sa hodnotí rôzne. Niektorí autori poukazujú na nízku kvalitu separácie pri použití tejto metódy, zatiaľ čo iní výskumníci naopak spomedzi všetkých možných metód uprednostňujú izoláciu HSC z pupočníkovej krvi pomocou 6 % roztoku hydroxyetylškrobu. Zároveň sa zdôrazňuje vysoká účinnosť sedimentácie krvotvorných buniek, ktorá podľa niektorých údajov dosahuje 84 % až 90 %.

Zástancovia odlišného pohľadu sa domnievajú, že prakticky všetky frakcionačné metódy sú spojené s veľkými stratami jadrových buniek a navrhujú separáciu vykonávať centrifugáciou, pričom sa pupočníková krv rozdelí na 3 frakcie: erytrocyty, leukocytový kruh a plazma. Izoláciou buniek týmto spôsobom autori zistili, že obsah mononukleárnych buniek, skorých hematopoetických progenitorových buniek a buniek s imunofenotypom CD34+ nakoniec predstavoval 90, 88 a 100 % pôvodnej úrovne. Podobné hodnoty pre nárast buniek pupočníkovej krvi purifikovaných touto metódou získali aj iní výskumníci: po sedimentácii bolo izolovaných 92 % jadrových buniek, 98 % mononukleárnych buniek, 96 % CD34-pozitívnych buniek a 106 % jednotiek tvoriacich kolónie.

Koncom 90. rokov 20. storočia sa želatína hojne používala ako sedimentačné činidlo. V klinickej praxi sa želatína používa na izoláciu hematopoetických kmeňových buniek z pupočníkovej krvi od roku 1994. Pri použití 3 % roztoku želatíny dosahuje účinnosť izolácie jadrových buniek 88 – 94 %. Rozsiahle používanie želatíny pri vytváraní banky pupočníkovej krvi potvrdilo jej výhody oproti iným sedimentačným činidlám. Porovnávacia analýza účinnosti všetkých vyššie uvedených metód izolácie jadrových buniek za podmienok ich postupného použitia na každej z testovaných vzoriek pupočníkovej krvi preukázala, že 3 % roztok želatíny je optimálnym sedimentačným činidlom z hľadiska výťažnosti mononukleárnych buniek s fenotypom CD34+/CD45+, ako aj z hľadiska počtu CFU-GM a CFU-GEMM. Metódy využívajúce gradient hustoty Ficoll, ako aj použitie hydroxyetylškrobu a metylcelulózy boli výrazne menej účinné, pričom straty hematopoetických buniek dosiahli 60 %.

Rozšírenie objemov transplantácií kmeňových buniek z pupočníkovej krvi je spojené nielen s vývojom metód ich získavania, ale aj skladovania. Existuje mnoho problémov priamo súvisiacich s prípravou pupočníkovej krvi na dlhodobé skladovanie a výberom optimálnej technológie kryokonzervácie jej vzoriek. Medzi ne patria otázky uskutočniteľnosti vykonávania separačných postupov, použitia rôznych kryokonzervačných médií a aplikácie metód na prípravu rozmrazených buniek na transplantáciu. Preprava vzoriek natívnej pupočníkovej krvi sa často vykonáva z oblastí vzdialených od hematologických centier. V tejto súvislosti vzniká problém prijateľných období skladovania pupočníkovej krvi od okamihu jej získania až po začiatok kryokonzervácie, čo je obzvlášť dôležité pri vytváraní bánk pupočníkovej krvi.

Štúdia funkčnej aktivity hematopoetických buniek v pupočníkovej krvi po dlhodobom skladovaní (až 12 rokov) v tekutom dusíku ukázala, že približne 95 % hematopoetických buniek počas tohto obdobia nestráca svoju vysokú proliferačnú kapacitu. V práci S. Yurasova a spoluautorov (1997) sa dokázalo, že skladovanie pupočníkovej krvi pri izbovej teplote (22 °C) alebo pri 4 °C počas 24 a 48 hodín významne neznižuje životaschopnosť hematopoetických buniek, ktorá predstavuje 92 %, respektíve 88 % pôvodnej úrovne. Ak sa však doba skladovania predĺži na tri dni, počet životaschopných jadrových buniek v pupočníkovej krvi sa výrazne zníži. Zároveň iné štúdie ukázali, že pri skladovaní počas 2 – 3 dní pri teplote 22 alebo 4 °C trpí predovšetkým životaschopnosť zrelých granulocytov, a nie hematopoetických buniek.

Životaschopnosť hematopoetických kmeňových buniek z pupočníkovej krvi môže byť negatívne ovplyvnená zložkami systémov na odber pupočníkovej krvi. Analýza účinku rôznych antikoagulancií, ktorých mechanizmus účinku je spôsobený väzbou vápnikových iónov (ACD, EDTA, XAPD-1) na hematopoetické progenitorové bunky za podmienok skladovania pupočníkovej krvi počas 24 až 72 hodín, odhalila ich negatívny vplyv na životaschopnosť jadrových buniek. V tejto súvislosti autori odporúčajú používať PBS (roztok fosfátového pufru) s prídavkom natívneho heparínu bez konzervačnej látky v koncentrácii 20 U/ml, čo podľa ich názoru umožňuje predĺžiť dobu skladovania nefrakcionovanej pupočníkovej krvi na 72 hodín a zachováva funkčnú aktivitu jednotiek tvoriacich kolónie. Štúdia bezpečnosti CFU-GM a CFU-G však ukázala, že doba skladovania pupočníkovej krvi pred kryokonzerváciou by nemala presiahnuť deväť hodín. V tomto prípade by sa samozrejme mala uplatňovať zásada, že v prípade protichodných údajov by sa mala použiť minimálna odporúčaná doba skladovania pupočníkovej krvi a čo najskôr by sa malo začať s programovaným zmrazovaním izolovaných buniek.

Pri mrazení hematopoetických kmeňových buniek z pupočníkovej krvi sa ako kryoprotektant zvyčajne používa 10 % roztok DMSO. Okrem výrazného kryoprotektívneho účinku má však dimetylsulfoxid v takejto koncentrácii aj priamy cytotoxický účinok, a to aj pri minimálnej expozícii hematopoetických buniek z pupočníkovej krvi. Na zníženie cytotoxického účinku DMSO sa používa nulová expozičná teplota, zvyšuje sa rýchlosť všetkých manipulácií a po rozmrazení vzoriek pupočníkovej krvi sa vykonáva viacnásobné premytie.

Od roku 1995 Inštitút hematológie a transfuziológie Akadémie lekárskych vied Ukrajiny rozvíja vedecký smer zameraný na komplexné štúdium pupočníkovej krvi ako alternatívneho zdroja hematopoetických kmeňových buniek. Predovšetkým boli vyvinuté nové technológie nízkoteplotnej kryokonzervácie hematopoetických buniek nefrakcionovanej a frakcionovanej pupočníkovej krvi. Ako kryoprotektant sa používa nízkomolekulárny medicínsky polyvinylpyrolidón. Metóda kryokonzervácie nefrakcionovanej pupočníkovej krvi je založená na originálnej technológii predprípravy buniek na zmrazenie a metóde špeciálneho spracovania bunkovej suspenzie bezprostredne pred transplantáciou.

Jedným z najdôležitejších faktorov ovplyvňujúcich úroveň funkčnej aktivity kryokonzervovaných hematopoetických kmeňových buniek je rýchlosť chladenia bunkovej suspenzie, najmä počas fázy kryštalizácie. Softvérový prístup k riešeniu problému rýchlosti a času mrazenia poskytuje veľké možnosti pre vytvorenie jednoduchých a vysoko účinných metód kryokonzervácie bez premytia bunkovej suspenzie z kryoprotektorov pred transplantáciou.

Najnebezpečnejšie štádiá pre životaschopnosť buniek počas ich prípravy sú štádiá priameho zmrazovania a rozmrazovania. Pri zmrazovaní hematopoetických buniek môže byť ich významná časť zničená v momente prechodu medzibunkového média z kvapalnej do pevnej fázy - kryštalizácie. Na zníženie percenta bunkovej smrti sa používajú kryoprotektory, ktorých mechanizmy účinku a kryoprotektívna účinnosť sú dostatočne opísané vo vedeckej literatúre.

Sľubným smerom optimalizácie metód kryokonzervácie buniek kostnej drene a pupočníkovej krvi je kombinácia nízkych koncentrácií niekoľkých kryoprotektorov s rôznymi mechanizmami účinku v jednom roztoku, napríklad DMSO pôsobiaceho na intracelulárnej úrovni a hydroxyetylškrobu alebo albumínu, ktoré majú extracelulárny ochranný účinok.

Na kryokonzerváciu buniek pupočníkovej krvi sa tradične používa 20 % roztok DMSO, ktorý sa pomaly pridáva do bunkovej suspenzie za stáleho mechanického miešania v ľadovom kúpeli, kým sa nedosiahne rovnaký pomer (1:1) objemu kryoprotektantu a bunkovej suspenzie. Konečná koncentrácia dimetylsulfoxidu je 10 %. Bunková suspenzia sa potom ochladí v programovanej kryogénnej jednotke rýchlosťou GS/min na -40 °C, po ktorej sa rýchlosť ochladzovania zvýši na 10 °C/min. Po dosiahnutí -100 °C sa nádoba s bunkovou suspenziou umiestni do tekutého dusíka (-196 °C). Pri tejto technike kryokonzervácie dosahuje zachovanie funkčne aktívnych mononukleárnych buniek po rozmrazení 85 % pôvodnej úrovne.

Modifikácie metód kryokonzervácie sú zamerané na zníženie koncentrácie DMSO pridaním hydroxyetylškrobu (konečné koncentrácie dimetylsulfoxidu a hydroxyetylškrobu sú 5 % a 6 %). Vysoká účinnosť takejto kombinácie kryoprotektorov sa pozoruje pri zmrazení suspenzie myeloidných buniek a pri nemenšej cytoprotekcii ako pri použití iba 10 % roztoku dimetylsulfoxidu. Počet životaschopných jadrových buniek dosiahol 96,7 % pôvodnej úrovne a ich funkčná aktivita, odhadnutá podľa počtu CFU-GM, bola 81,8 %.

Pri použití roztoku dimetylsulfoxidu v koncentráciách od 5 do 10 % v kombinácii so 4 % hydroxyetylškrobom (konečná koncentrácia) sa zistilo, že bezpečnosť CD34-pozitívnych buniek v takýchto rozsahoch dimetylsulfoxidu zostáva prakticky nezmenená. Zároveň, keď sa koncentrácia dimetylsulfoxidu zníži z 5 na 2,5 %, pozoruje sa masívna smrť buniek pupočníkovej krvi - počet životaschopných bunkových jednotiek sa znižuje z 85,4 na 12,2 %. Aj iní autori dospeli k záveru, že práve 5 a 10 % roztoky dimetylsulfoxidu (v autorovej verzii - v kombinácii s autológnym sérom) poskytujú cytoprotekciu s maximálnou účinnosťou počas kryokonzervácie HSC pupočníkovej krvi. Okrem toho sa zaznamenáva vysoká konzervácia postupne zmrazených a rozmrazených buniek v prípade kombinácie 5 alebo 10 % dimetylsulfoxidu so 4 % roztokom hydroxyetylškrobu, najmä pri kontrolovanej rýchlosti chladenia GS/min. V inej štúdii bol použitý kryoprotektívny roztok pozostávajúci z troch zložiek - DMSO, purifikovaného ľudského albumínu a média RPMI v pomere 1:4:5, ktorý bol pridaný do bunkovej suspenzie v rovnakom objemovom pomere (konečná koncentrácia dimetylsulfoxidu bola 5 %). Po rozmrazení vo vodnom kúpeli pri teplote +4 GS presiahla konzervácia CFU-GM 94 %.

Niektorí autori navrhujú použitie nefrakcionovanej pupočníkovej krvi na kryokonzerváciu, pretože počas procesu odstraňovania červených krviniek sa stráca významné množstvo hematopoetických buniek. V tomto variante sa na ochranu mononukleárnych buniek pred škodlivými účinkami kryokryštalizácie používa 10 % roztok dimetylsulfoxidu. Zmrazovanie sa vykonáva konštantnou rýchlosťou ochladzovania GS/min na -80 °C, po čom sa suspenzia buniek pupočníkovej krvi ponorí do tekutého dusíka. Táto metóda zmrazovania vedie k čiastočnej lýze červených krviniek, takže vzorky krvi nevyžadujú frakcionáciu. Po rozmrazení sa bunková suspenzia premyje od voľného hemoglobínu a dimetylsulfoxidu v roztoku ľudského albumínu alebo v autológnom krvnom sére pacienta a použije sa na transplantáciu.

Zachovanie hematopoetických progenitorových buniek po rozmrazení nefrakcionovanej pupočníkovej krvi je skutočne vyššie ako u frakcionovanej pupočníkovej krvi, avšak vzhľadom na kryostatitu niektorých erytrocytov môžu vzniknúť vážne problémy po transfúzii v dôsledku transfúzie erytrocytov nekompatibilných s ABO. Okrem toho sa výrazne zvyšuje objem uskladnenej nefrakcionovanej krvi. Z klinického hľadiska je stále výhodnejšia kryokonzervácia hematopoetických buniek z pupočníkovej krvi predtým izolovaných a purifikovaných z iných bunkových frakcií.

Konkrétne bola vyvinutá metóda kryokonzervácie frakcionovaných buniek pupočníkovej krvi, ktorá umožňuje odstránenie erytrocytov v štádiu prípravy na zmrazenie, pri ktorej sa ako súčasť plazma-substitučného roztoku „Stabiloz“ používa 6 % roztok hydroxyetylškrobu. Po rozmrazení je takto získaná bunková suspenzia pripravená na klinické použitie bez ďalších manipulácií.

V súčasnosti teda existuje mnoho pomerne účinných metód kryokonzervácie pupočníkovej krvi. Ich zásadný rozdiel spočíva v tom, že vzorky krvi sa zmrazujú nefrakcionované alebo sa v štádiu prípravy podrobujú separácii na bunkové frakcie a pripravujú sa jadrové bunky bez prímesi erytrocytov.

Transplantácia hematopoetických kmeňových buniek z pupočníkovej krvi

Koncom 80. a začiatkom 90. rokov 20. storočia sa zistilo, že pupočníková krv, ktorá poskytuje plodu podporu života počas tehotenstva, má vysoký obsah hematopoetických kmeňových buniek. Relatívna jednoduchosť získavania buniek pupočníkovej krvi a absencia zjavných etických problémov prispeli k využitiu kmeňových buniek pupočníkovej krvi v praktickej medicíne. Prvá úspešná transplantácia pupočníkovej krvi dieťaťu s Fanconiho anémiou slúžila ako východiskový bod pre rozšírenie objemu transplantácií kmeňových buniek pupočníkovej krvi a vytvorenie systému pre jej uchovávanie. V svetovom systéme bánk pupočníkovej krvi je najväčšou Newyorské centrum placenty krvi, ktoré je v súvahe Národného inštitútu zdravia USA. Počet uložených vzoriek pupočníkovej krvi v tejto banke sa blíži k 20 000. Rastie aj počet príjemcov (väčšinou detí), ktorí podstúpili úspešnú transplantáciu. Podľa Ministerstva zdravotníctva USA obdobie bez recidívy po transplantácii u príjemcov transplantovanej pupočníkovej krvi už presahuje 10 rokov.

To nie je prekvapujúce, keďže početné štúdie hematopoetického potenciálu pupočníkovej krvi ukázali, že z hľadiska množstva a kvality najskorších kmeňových buniek nielenže nie je horšia ako kostná dreň dospelého, ale v niektorých ohľadoch ju aj prekonáva. Vyšší proliferačný potenciál kmeňových buniek pupočníkovej krvi je spôsobený ontogenetickými vlastnosťami bunkovej signalizácie, prítomnosťou receptorov pre špecifické rastové faktory na HSC, schopnosťou buniek pupočníkovej krvi autokrinne produkovať rastové faktory a veľkou veľkosťou a dĺžkou telomér.

Genomické a fenotypové charakteristiky hematopoetických kmeňových buniek z pupočníkovej krvi teda predurčujú kvalitné uchytenie transplantátu s vysokým potenciálom pre obnovu hematopoézy darcu v tele príjemcu.

Výhody hematopoetických kmeňových buniek z pupočníkovej krvi

Medzi skutočné výhody použitia hematopoetických kmeňových buniek z pupočníkovej krvi na transplantáciu oproti iným zdrojom hematopoetických buniek stojí za zmienku prakticky nulové riziko pre zdravie darcu (ak neberieme do úvahy placentu) a absenciu potreby celkovej anestézie. Použitie pupočníkovej krvi rozširuje možnosti transplantácie buniek vďaka čiastočne HLA-kompatibilným transplantátom (nekompatibilita od jedného do troch antigénov). Bola vyvinutá metóda dlhodobého skladovania hematopoetických buniek z pupočníkovej krvi v zmrazenom stave, ktorá zvyšuje pravdepodobnosť získania vzácnych HLA typov a skracuje čas hľadania HLA-kompatibilného transplantátu pre alogénnu transplantáciu. Zároveň sa výrazne znižuje riziko vzniku niektorých latentných infekcií prenášaných prenosnými cestami. Okrem toho vzniká lacná forma biologického životného poistenia vďaka možnosti použitia buniek z pupočníkovej krvi na autológnu transplantáciu.

Avšak vzhľadom na malé objemy krvi, ktoré je možné odobrať z placenty (v priemere nie viac ako 100 ml), sa do popredia dostáva problém získania maximálneho možného množstva krvi z pupočníkovej žily pri prísnom dodržiavaní podmienky minimálneho rizika bakteriálnej kontaminácie odobratých vzoriek pupočníkovej krvi.

Primitívne hematopoetické bunky z pupočníkovej krvi sa zvyčajne identifikujú na základe prítomnosti glykofosfoproteínu CD34 na ich povrchu, ako aj na základe ich funkčných vlastností štúdiom klonogenity alebo tvorby kolónií in vitro. Porovnávacia analýza ukázala, že v pupočníkovej krvi a kostnej dreni je maximálny obsah CD34-pozitívnych buniek v mononukleárnej frakcii 1,6 % a 5,0 %, maximálna hladina jednotiek tvoriacich kolónie v subpopulácii buniek CD34+ je 80 % a 25 %, celková účinnosť klonovania buniek CD34+ je 88 % a 58 %, maximálny obsah buniek tvoriacich kolónie s vysokým proliferačným potenciálom (HPP-CFC v populácii CD34+) je 50 % a 6,5 %. Treba dodať, že účinnosť klonovania buniek CD34+CD38 a schopnosť reagovať na stimuláciu cytokínmi sú tiež vyššie v hematopoetických kmeňových bunkách z pupočníkovej krvi.

Kombinácia fenotypových antigénov Thy-1, CD34 a CD45RA potvrdzuje vysoký proliferačný potenciál hematopoetických buniek pupočníkovej krvi a expresia týchto troch antigénov na povrchu buniek pupočníkovej krvi naznačuje ich príslušnosť ku kmeňovým bunkám. Okrem toho sa zistilo, že pupočníková krv obsahuje bunky s fenotypom CD34+, ktoré nemajú markery lineárnej diferenciácie. Hladina bunkových subpopulácií s fenotypovým profilom CD34+/Lin v pupočníkovej krvi je približne 1 % z celkového počtu CD34-pozitívnych buniek. Hematopoetické progenitorové bunky z pupočníkovej krvi dávajú vznik lymfoidnej bunkovej línii aj pluripotentnej myeloidnej sérii lineárnej bunkovej diferenciácie, čo tiež naznačuje ich príslušnosť ku kmeňovým bunkám.

Ako už bolo spomenuté, významné rozdiely medzi kostnou dreňou a pupočníkovou krvou spočívajú v množstve hematopoetických buniek použitých na transplantáciu získaných počas jedného odberového postupu. Ak je počas transplantácie kostnej drene strata bunkovej hmoty počas separácie, kryokonzervácie, rozmrazovania a testovania prijateľná v rozmedzí 40 – 50 %, potom sú v prípade pupočníkovej krvi takéto straty buniek veľmi významné, pretože ak sa použije nedostatočné množstvo HSC, transplantácia sa môže ukázať ako neúčinná. Podľa G. Koglera a kol. (1998) pri transplantácii buniek s telesnou hmotnosťou príjemcu 10 kg môžu byť všetky vzorky pupočníkovej krvi potenciálnymi transplantátmi (celkový počet odobratých vzoriek pupočníkovej krvi je 2098), s telesnou hmotnosťou 35 kg – 67 % a iba 25 % vzoriek môže zabezpečiť účinnú transplantáciu u pacientov s telesnou hmotnosťou 50 – 70 kg. Táto klinická situácia naznačuje potrebu optimalizovať a zlepšiť účinnosť existujúcich metód zberu, reprodukcie a skladovania buniek pupočníkovej krvi. Preto sa v literatúre v súčasnosti široko diskutuje o otázkach štandardizácie metód zberu, testovania, separácie a kryokonzervácie pupočníkovej krvi na vytvorenie krvných bánk, jej použití v klinickej praxi a tiež o stanovovaní podmienok a termínov uchovávania hematopoetických kmeňových buniek z pupočníkovej krvi.

[ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Využitie hematopoetických kmeňových buniek z pupočníkovej krvi v medicíne

^{Z pupočníkovej krvi je zvyčajne možné izolovať až 10⁶} hematopoetických kmeňových buniek, zriedkavo viac. V tomto ohľade zostáva dodnes otvorená otázka, či takéto množstvo hematopoetických buniek z pupočníkovej krvi postačuje na obnovenie hematopoézy u dospelého príjemcu. Názory na túto vec sú rozdelené. Niektorí výskumníci sa domnievajú, že takéto množstvo je úplne postačujúce na transplantáciu deťom, ale príliš malé na transplantáciu dospelému, pre ktorého je optimálnym množstvom zavedenie (7-10) x 10⁶ ^CD34 -pozitívnych buniek na 1 kg telesnej hmotnosti - v priemere 7 x 10⁶ ^na transplantáciu. Z týchto výpočtov vyplýva, že jedna vzorka pupočníkovej krvi obsahuje 700-krát menej hematopoetických kmeňových buniek, ako je potrebné na jednu transplantáciu dospelému pacientovi. Takéto kvantitatívne hodnotenie sa však vykonáva analogicky s počtom transfúzovaných buniek kostnej drene a vôbec nezohľadňuje ontogenetické vlastnosti hematopoézy.

Predovšetkým sa ignoruje fakt vyššieho proliferačného potenciálu hematopoetických kmeňových buniek z pupočníkovej krvi v porovnaní s hematopoetickými progenitorovými bunkami z kostnej drene. Výsledky štúdií potenciálu tvorby kolónií in vitro naznačujú, že jedna dávka pupočníkovej krvi je schopná zabezpečiť rekonštitúciu hematopoézy dospelého príjemcu. Na druhej strane by sa nemalo zabúdať, že počet kmeňových buniek z pupočníkovej krvi klesá už počas embryonálneho vývoja: obsah CD34-pozitívnych buniek v pupočníkovej krvi lineárne klesá 5-násobne v období od 20. týždňa (krv na štúdiu bola odobratá počas predčasného ukončenia tehotenstva) do 40. týždňa tehotenstva (obdobie fyziologického pôrodu), čo je sprevádzané paralelnou, trvalo rastúcou expresiou lineárnych cytodiferenciačných markerov.

Vzhľadom na nedostatok štandardizovaného prístupu ku kvantitatívnemu stanoveniu progenitorových buniek vo vzorkách pupočníkovej krvi pokračujú diskusie o optimálnej dávke hematopoetických kmeňových buniek z pupočníkovej krvi. Niektorí výskumníci sa domnievajú, že ako kritérium pre výber vzoriek pupočníkovej krvi možno použiť počet jadrových buniek a mononukleárnych buniek prepočítaný na telesnú hmotnosť príjemcu, teda ich dávku. Niektorí autori sa domnievajú, že minimálny kvantitatívny prah CD34+ buniek aj pre autotransplantáciu HSC je 2 x 106 ^/ kg. Zároveň zvýšenie dávky hematopoetických buniek na 5 x 106 ^buniek /kg (iba 2,5-násobok) už zabezpečuje priaznivejší priebeh skorého posttransplantačného obdobia, znižuje výskyt infekčných komplikácií a skracuje trvanie preventívnej antibiotickej liečby.

Podľa E. Gluckmana a kol. (1998) je v onkohematológii podmienkou úspešnej transplantácie buniek pupočníkovej krvi zavedenie najmenej 3,7 x 10⁻⁹ ^jadrových buniek na 1 kg telesnej hmotnosti príjemcu. Keď sa dávka hematopoetických kmeňových buniek zníži na 1 x 10⁻⁹ ^alebo menej jadrových buniek na 1 kg telesnej hmotnosti pacienta, riziko zlyhania transplantácie a relapsu rakoviny krvi prudko stúpa. Treba si uvedomiť, že minimálny počet progenitorových buniek potrebný na rýchle obnovenie hematopoézy po alotransplantácii HSC stále nie je známy. Teoreticky sa to dá dosiahnuť pomocou jednej bunky, ale v klinickej praxi transplantácie kostnej drene je rýchle a stabilné uchytenie zaručené transfúziou najmenej (1-3) x 10⁻⁹ ^jadrových buniek na 1 kg telesnej hmotnosti pacienta.

Nedávna podrobná štúdia zameraná na určenie optimálneho počtu HSC v onkohematológii zahŕňala pozorovanie pacientov v troch skupinách, rozdelených v závislosti od obsahu CD34-pozitívnych buniek v transplantovanom materiáli. Pacientom v prvej skupine bolo podaných (3-5) x 106 ^buniek /kg. Dávka HSC u pacientov v druhej skupine bola (5-10) x 106 ^buniek /kg a pacientom v tretej skupine bolo transplantovaných viac ako 10 x 106 ^CD34 + buniek/kg. Najlepšie výsledky sa pozorovali v skupine príjemcov, ktorí dostali transplantát s počtom CD34-pozitívnych buniek rovným (3-5) x 106 ^/ kg. So zvýšením dávky transplantovaných buniek nad 5 x 106 ^/ kg sa štatisticky významné výhody nezistili. V tomto prípade je veľmi vysoký obsah HSC v transplantáte (> 10 x 106 ^/ kg) spojený s reinfúziou významného počtu zvyškových nádorových buniek, čo vedie k relapsu ochorenia. Priamy vzťah medzi počtom transplantovaných alogénnych progenitorových buniek a vývojom reakcie štep verzus hostiteľ nebol stanovený.

Nahromadené svetové skúsenosti s transplantáciou pupočníkovej krvi potvrdzujú jej vysoký repopulačný potenciál. Rýchlosť uchytenia transplantátu pupočníkovej krvi koreluje s počtom zavedených jadrových buniek. Najlepšie výsledky sa pozorujú pri transplantácii 3 x 10 ⁷ /kg, zatiaľ čo v prípade kostnej drene je táto dávka 2 x 10 ⁸ /kg. Podľa údajov koordinačných centier bolo koncom roka 2000 vykonaných na celom svete 1200 transplantácií buniek pupočníkovej krvi, prevažne od príbuzných darcov (83 %). Je zrejmé, že pupočníkovú krv by sme mali zvážiť ako alternatívu ku kostnej dreni pri transplantácii pacientom s hemoblastózami.

Zároveň neonatálna povaha pupočníkovej krvi ako zdroja hematopoetického tkaniva vzbudzuje optimizmus vzhľadom na prítomnosť funkčných vlastností jej HSC. Zároveň iba klinické skúsenosti môžu odpovedať na otázku, či je dostatočná jedna vzorka pupočníkovej krvi na obnovenie hematopoézy u dospelého príjemcu s hematopoetickou apláziou. Transplantácia buniek pupočníkovej krvi sa používa v liečebných programoch pre mnohé nádorové a nenádorové ochorenia: leukémia a myelodysplastické syndrómy, non-Hodgkinov lymfóm a neuroblastóm, aplastická anémia, vrodené Fanconiho a Diamond-Blackfanove anémie, deficit adhézie leukocytov, Barrov syndróm, Guntherova choroba, Hurlerov syndróm, talasémia.

Imunologické aspekty transplantácie hematopoetických buniek z pupočníkovej krvi si zaslúžia dôkladnú pozornosť a samostatnú štúdiu. Ukázalo sa, že v prípade transplantácie kmeňových buniek z pupočníkovej krvi od darcov s neúplnou HLA kompatibilitou sú výsledky transplantácie celkom uspokojivé, čo podľa autorov naznačuje nižšiu imunoreaktivitu buniek z pupočníkovej krvi ako kostnej drene.

Podrobná štúdia bunkového zloženia pupočníkovej krvi odhalila vlastnosti fenotypového spektra efektorových buniek imunitného systému a ich funkčnej aktivity, čo umožnilo považovať pupočníkovú krv za zdroj HSC s relatívne nízkym rizikom vzniku reakcie „štep verzus hostiteľ“. Medzi znaky funkčnej nezrelosti imunokompetentných buniek pupočníkovej krvi je potrebné poznamenať nerovnováhu v produkcii cytokínov a zníženie citlivosti imunitnej odpovede na cytokínovú reguláciu. Výsledná inhibícia aktivity cytotoxických lymfocytov sa považuje za faktor prispievajúci k tvorbe imunologickej tolerancie voči transplantovanému hematopoetickému tkanivu. V populácii lymfocytov pupočníkovej krvi, na rozdiel od periférnej krvi a kostnej drene dospelých darcov, prevládajú neaktívne, nezrelé lymfocyty a supresorové bunky. To naznačuje zníženú pripravenosť T-lymfocytov pupočníkovej krvi na imunitnú odpoveď. Dôležitým znakom monocytovej populácie buniek pupočníkovej krvi je nízky obsah funkčne plnohodnotných a aktívnych antigén prezentujúcich buniek.

Na jednej strane nízka zrelosť efektorových buniek imunitného systému v pupočníkovej krvi rozširuje indikácie pre jej použitie v klinickej praxi, pretože tieto vlastnosti zabezpečujú zníženie intenzity imunitného konfliktu medzi bunkami darcu a príjemcu. Na druhej strane je však známa existencia korelácie medzi stupňom vývoja reakcie „štep verzus hostiteľ“ a protinádorovým účinkom transplantácie, teda vývojom efektu „štep verzus leukémia“. V tejto súvislosti bola vykonaná štúdia protinádorovej cytotoxicity buniek pupočníkovej krvi. Získané výsledky naznačujú, že napriek skutočne oslabenej odpovedi imunokompetentných buniek pupočníkovej krvi na stimuláciu antigénom sú primárne aktivované lymfocyty prirodzené zabíjače a bunky podobné zabíjačom, ktoré sa aktívne podieľajú na mechanizmoch implementácie protinádorovej cytotoxicity. Okrem toho sa v pupočníkovej krvi našli subpopulácie lymfocytov s fenotypmi CD16+CD56+ a CD16"TCRa/p+. Predpokladá sa, že tieto bunky v aktivovanej forme realizujú reakciu „štep verzus leukémia“.

V Onkologickom ústave Akadémie lekárskych vied Ukrajiny boli pacientom s rakovinou s pretrvávajúcou hematopoetickou hypopláziou v dôsledku chemoterapie a rádioterapie podávané kryokonzervované hematopoetické bunky z pupočníkovej krvi. U takýchto pacientov transplantácia hematopoetických kmeňových buniek z pupočníkovej krvi pomerne účinne obnovila utlmenú hematopoézu, o čom svedčí pretrvávajúci nárast obsahu zrelých formovaných prvkov v periférnej krvi, ako aj zvýšenie ukazovateľov charakterizujúcich stav bunkovej a humorálnej imunity. Stabilita repopulačného účinku po transplantácii hematopoetických buniek z pupočníkovej krvi umožňuje pokračovanie v rádioterapii a chemoterapii bez prerušenia liečebného cyklu. Existujú informácie o vyššej účinnosti alotransplantácie kmeňových buniek z pupočníkovej krvi onkohematologickým pacientom: ročné riziko relapsu nádorového ochorenia pri ich použití bolo 25 % oproti 40 % u pacientov s transplantovanou alogénnou kostnou dreňou.

Mechanizmus účinku kryokonzervovaných kmeňových buniek z pupočníkovej krvi by sa mal považovať za výsledok humorálnej stimulácie hematopoézy príjemcu spôsobenej jedinečnou schopnosťou neonatálnych buniek autokrinne produkovať hematopoetické rastové faktory, ako aj za dôsledok dočasného uchytenia darcovských buniek (o čom svedčí spoľahlivé zvýšenie obsahu fetálneho hemoglobínu v periférnej krvi príjemcov 7. – 15. deň po transfúzii v porovnaní s počiatočnými údajmi). Absencia posttransfúznych reakcií u príjemcov pupočníkovej krvi je výsledkom relatívnej tolerancie jej imunokompetentných buniek, ako aj kritériom spoľahlivosti biologickej adekvátnosti kryokonzervovaného materiálu.

Progenitorové bunky zabíjajúce T-lymfocyty z pupočníkovej krvi sú schopné aktivácie pod vplyvom exogénnej cytokínovej stimulácie, čo sa používa na vývoj nových ex vivo a in vivo metód na indukciu protinádorovej cytotoxicity transplantovaných lymfoidných elementov pre následnú imunoterapiu. Okrem toho „nezrelosť“ genómu imunokompetentných buniek z pupočníkovej krvi umožňuje ich použitie na zvýšenie protinádorovej aktivity pomocou metód molekulárneho modelovania.

Dnes pupočníková krv našla široké uplatnenie predovšetkým v detskej hematológii. U detí s akútnou leukémiou alotransplantácia hematopoetických kmeňových buniek z pupočníkovej krvi v porovnaní s alotransplantáciou kostnej drene významne znižuje výskyt reakcie štepu proti hostiteľovi. To je však sprevádzané dlhším obdobím neutro- a trombocytopénie a, žiaľ, aj vyššou 100-dňovou úmrtnosťou po transplantácii. Dlhšie obdobie obnovy hladín granulocytov a krvných doštičiek v periférnej krvi môže byť spôsobené nedostatočnou diferenciáciou jednotlivých subpopulácií CD34-pozitívnych buniek pupočníkovej krvi, o čom svedčí nízka úroveň absorpcie rádioaktívneho rodamínu a nízka expresia antigénov CD38 na ich povrchu.

Zároveň transplantácia hematopoetických kmeňových buniek z pupočníkovej krvi dospelým pacientom, vykonaná z dôvodu absencie kompatibilného nepríbuzného darcu kostnej drene a možnosti mobilizácie autológnych HSC, preukázala vysoké jednoročné prežívanie bez relapsu v skupine pacientov mladších ako 30 rokov (73 %). Rozšírenie vekového rozpätia príjemcov (18 – 46 rokov) viedlo k poklesu prežívania na 53 %.

Kvantitatívna analýza buniek s fenotypom CD34+ v kostnej dreni a pupočníkovej krvi odhalila ich vyšší (3,5-násobný) obsah v kostnej dreni, ale v pupočníkovej krvi bola zaznamenaná významná prevaha buniek s fenotypovým profilom CD34+HLA-DR. Je známe, že krvinky s imunologickými markermi CD34+HLA-DR proliferujú aktívnejšie ako bunky s imunofenotypom CD34+HLA-DR+, čo bolo potvrdené v experimentálnych štúdiách rastu dlhodobej kultúry hematopoetických buniek in vitro. Primitívne bunkové prekurzory s fenotypom CD34+CD38 sú obsiahnuté v pupočníkovej krvi aj kostnej dreni, ale bunky pupočníkovej krvi so sadou markerov CD34+CD38 majú vyššiu klonogénnu aktivitu ako hematopoetické bunky rovnakého fenotypu izolované z kostnej drene dospelých darcov. Okrem toho bunky pupočníkovej krvi s imunofenotypom CD34+CD38 proliferujú rýchlejšie v reakcii na stimuláciu cytokínmi (IL-3, IL-6, G-CSF) a v dlhodobých kultúrach produkujú 7-krát viac kolónií ako bunky kostnej drene.

Banky kmeňových buniek z pupočníkovej krvi

Pre správny rozvoj novej oblasti praktickej medicíny - transplantácie kmeňových buniek z pupočníkovej krvi, ako aj pre implementáciu transplantácií hematopoetických kmeňových buniek kostnej drene, je potrebná rozsiahla sieť krvných bánk, ktoré už boli vytvorené v USA a Európe. Domáce siete bánk pupočníkovej krvi združuje Asociácia Netcord Bank. Účelnosť vytvorenia medzinárodnej asociácie bánk pupočníkovej krvi je daná skutočnosťou, že na vykonanie nepríbuzných transplantácií je potrebný veľký počet typizovaných vzoriek pupočníkovej krvi, čo umožňuje výber HLA-identického darcu. Iba vytvorenie systému bánk s uložením vzoriek krvi rôznych HLA typov môže skutočne vyriešiť problém nájdenia potrebného darcu. Organizácia takéhoto systému bánk pupočníkovej krvi si vyžaduje predbežné vypracovanie etických a právnych noriem, o ktorých sa v súčasnosti diskutuje na medzinárodnej úrovni.

Na vytvorenie bánk pupočníkovej krvi na Ukrajine je potrebné vypracovať celý rad predpisov a dokumentov.

V prvom rade ide o otázky štandardizácie metód odberu, frakcionácie a mrazenia pupočníkovej krvi. Je potrebné regulovať pravidlá odberu pupočníkovej krvi v pôrodniciach v súlade s požiadavkami lekárskej etiky, určiť minimálny objem pupočníkovej krvi, ktorý zabezpečuje úspešnú transplantáciu. Je potrebné porovnať a štandardizovať rôzne kritériá na hodnotenie kvality a množstva hematopoetických progenitorových buniek, ako aj metódy HLA typizácie a diagnostické metódy genetických a infekčných ochorení, ktoré sa môžu prenášať počas infúzie buniek pupočníkovej krvi, stanoviť spoločné kritériá pre výber zdravých darcov. Za zmienku stojí aj otázka vytvorenia samostatných skladovacích priestorov pre sérum, bunky a DNA získanú z pupočníkovej krvi.

Je absolútne nevyhnutné zorganizovať počítačovú sieť údajov o pupočníkovej krvi, ktorá by sa prepojila s registrami darcov kostnej drene. Pre ďalší rozvoj bunkovej transplantológie je potrebné vyvinúť špeciálne protokoly na porovnávanie výsledkov transplantácie pupočníkovej krvi a kostnej drene od HLA-identických príbuzných a nepríbuzných darcov. Štandardizácia dokumentácie vrátane informovaného súhlasu rodičov, ako aj informovania matky alebo príbuzných o genetických a/alebo infekčných ochoreniach zistených u dieťaťa, môže pomôcť vyriešiť etické a právne problémy klinického použitia buniek pupočníkovej krvi.

Rozhodujúcou podmienkou rozvoja bunkovej transplantológie na Ukrajine bude prijatie Národného programu darcovstva kmeňových buniek a rozvoj medzinárodnej spolupráce s inými krajinami prostredníctvom Svetovej asociácie darcov drene (WMDA), Národného programu darcovstva drene USA (NMDP) a ďalších registrov.

Ak zhrnieme zatiaľ krátku históriu vývoja transplantácie hematopoetických kmeňových buniek z pupočníkovej krvi, poznamenávame, že prvé predpoklady o možnosti použitia pupočníkovej krvi v klinických podmienkach, vyjadrené už začiatkom 70. rokov, boli v 80. rokoch potvrdené výsledkami experimentálnych štúdií na zvieratách a v roku 1988 bola vykonaná prvá transplantácia hematopoetických buniek z pupočníkovej krvi človeku na svete, po ktorej sa začala vytvárať globálna sieť bánk pupočníkovej krvi. Za 10 rokov sa počet pacientov s transplantovanými hematopoetickými bunkami z pupočníkovej krvi priblížil k 800. Medzi nimi boli pacienti s rôznymi ochoreniami nádorového (leukémia, lymfóm, solídne nádory) a nenádorového (vrodené imunodeficiencie, anémia, ochorenia spojené s metabolickými poruchami) charakteru.

Obsah skorých a viazaných bunkových prekurzorov v pupočníkovej krvi je vyšší ako v periférnej krvi dospelého. Z hľadiska počtu jednotiek tvoriacich kolónie granulocytov a makrofágov a ich proliferačného potenciálu pupočníková krv výrazne prevyšuje periférnu krv dospelých aj po zavedení rastových faktorov. V dlhodobých bunkových kultúrach in vitro bola zaznamenaná väčšia proliferačná aktivita a životaschopnosť buniek pupočníkovej krvi ako buniek kostnej drene. Kritickými momentmi pri transplantácii kmeňových buniek z pupočníkovej krvi sú počet a hematopoetický potenciál jadrových buniek, prítomnosť cytomegalovírusovej infekcie, HLA kompatibilita darcu a príjemcu, telesná hmotnosť a vek pacienta.

Transplantácia kmeňových buniek z pupočníkovej krvi by sa však mala zvážiť ako alternatíva k transplantácii kostnej drene na liečbu závažných ochorení krvi, predovšetkým u detí. Klinické problémy transplantácie buniek z pupočníkovej krvi sa postupne riešia - už existujú pomerne účinné metódy na zber, separáciu a kryokonzerváciu buniek z pupočníkovej krvi, zabezpečujú sa podmienky na vytváranie bánk pupočníkovej krvi a zlepšujú sa metódy testovania jadrových buniek. 3% roztok želatíny a 6% roztok hydroxyetylškrobu by sa mali považovať za optimálne na separáciu pri veľkom odbere hematopoetických kmeňových buniek z pupočníkovej krvi pri vytváraní bánk.

P. Perekhrestenko a spoluautori (2001) správne poznamenávajú, že transplantácia kmeňových buniek z pupočníkovej krvi by mala zaujať svoje právoplatné miesto v komplexe terapeutických opatrení na prekonanie hematopoetických depresií rôzneho pôvodu, pretože kmeňové bunky z pupočníkovej krvi majú množstvo významných výhod, medzi ktorými sú najdôležitejšie relatívna jednoduchosť ich získavania, absencia rizika pre darcu, nízka kontaminácia novorodeneckých buniek vírusmi a relatívne nízke náklady na transplantáciu. Niektorí autori poukazujú na to, že transplantácia buniek z pupočníkovej krvi je menej často sprevádzaná komplikáciami spojenými s reakciou štep verzus hostiteľ ako transplantácia buniek kostnej drene, čo je podľa ich názoru spôsobené slabou expresiou antigénov HLA-DR na bunkách z pupočníkovej krvi a ich nezrelosťou. Hlavnou populáciou jadrových buniek v pupočníkovej krvi sú však T-lymfocyty (CD3-pozitívne bunky), ktorých obsah je približne 50 %, čo je o 20 % menej ako v periférnej krvi dospelého, ale fenotypové rozdiely v subpopuláciách T-buniek z týchto zdrojov sú nevýznamné.

Medzi faktory priamo ovplyvňujúce mieru prežitia pri transplantácii kmeňových buniek z pupočníkovej krvi stojí za zmienku vek pacientov (najlepšie výsledky sa pozorujú u príjemcov vo veku od jedného do piatich rokov), včasná diagnostika ochorenia a forma leukémie (účinnosť je výrazne vyššia pri akútnej leukémii). Veľký význam má dávka jadrových buniek z pupočníkovej krvi, ako aj ich HLA kompatibilita s príjemcom. Nie je náhoda, že analýza klinickej účinnosti transplantácie HSC z pupočníkovej krvi v onkohematológii ukazuje najlepšie výsledky liečby pri použití príbuzných transplantátov: jednoročné prežitie bez relapsu v tomto prípade dosahuje 63 %, zatiaľ čo pri nepríbuznej transplantácii - iba 29 %.

Prítomnosť veľkého počtu kmeňových buniek v pupočníkovej krvi a vysoká repopulačná kapacita novorodeneckých hematopoetických kmeňových buniek teda umožňuje ich použitie na alogénnu transplantáciu u onkohematologických pacientov. Treba však poznamenať, že obnova hematopoézy po transplantácii hematopoetických buniek z pupočníkovej krvi je „natiahnutá v čase“: obnovenie obsahu neutrofilov v periférnej krvi sa zvyčajne pozoruje do konca 6. týždňa a trombocytopénia zvyčajne vymizne po 6 mesiacoch. Okrem toho nezrelosť hematopoetických buniek z pupočníkovej krvi nevylučuje imunologické konflikty: závažná akútna a chronická reakcia štepu proti hostiteľovi sa pozoruje u 23 % a 25 % príjemcov. Recidívy akútnej leukémie do konca prvého roka po transplantácii buniek z pupočníkovej krvi sa zaznamenávajú v 26 % prípadov.

[ 10 ], [ 11 ]