Embryonálne kmeňové bunky

Objav embryonálnych kmeňových buniek nevznikol náhodou, ale objavil sa na pripravenej pôde vedeckého výskumu v oblasti vývojovej biológie. Pojem „kmeňová bunka“ zaviedol do medicíny v roku 1908 na kongrese hematologickej spoločnosti v Berlíne Alexander Maximov v súvislosti s hematopoetickými bunkami. Dlho pred izoláciou a produkciou stabilných línií pluripotentných embryonálnych kmeňových buniek sa kmeňové terato-(embryokarcinómové) bunky používali v štúdiách procesov raného vývoja, pomocou ktorých sa študovali neznáme mechanizmy embryogenézy vrátane sekvencie expresie skorých génov a proteínových produktov ich aktivity.

Ale je totipotencia ľudského genómu v procese evolúcie nenávratne stratená? Nie, a embryogenéza je toho dôkazom. Ak je to tak, kedy sa v princípe naplní druhá cesta evolučného vývoja? Pravdepodobne, keď človek vstúpi do vesmíru, kde budú podmienky prostredia relatívne konštantné po dostatočne dlhú dobu. Strata kostného tkaniva (demineralizácia kostí v stave beztiaže), ktoré veľmi pomaly podlieha prestavbe a regenerácii, sa môže považovať za prvý krok v procese adaptácie človeka ako druhu na existenciu v kozmických podmienkach. Cena za druhú cestu evolučného vývoja však bude iná - cenou za návrat totipotencie a absolútnej plasticity všetkým bunkám bude sterilita. Takže v tomto svete „evolučných chameleónov“ sa budeme musieť rozmnožovať bez meiózy, pučaním. Ale budeme žiť dlho. Nesmrteľnosť telomerázy je nesmrteľnosťou améby. V mnohobunkovom organizme sú kmeňové bunky substrátom kvantitatívnej a kvalitatívnej dlhovekosti.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Zdroje embryonálnych kmeňových buniek

Zdrojmi embryonálnych kmeňových buniek pre laboratórny výskum sú dnes línie embryonálnych kmeňových buniek myšieho teratokarcinómu (129/sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Rl, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) a ľudského teratokarcinómu (klon NTERA-2, TERA-2, H-9), ako aj línie Trauneon ESC. Dostupnosť podrobného bunkového pasu s uvedením imunitného fenotypu, výsledkov chromozomálnej analýzy, profilov expresie mRNA, exponovaných receptorov a intracelulárnych signálnych proteínov však nekompenzuje významné nedostatky línií ESC teratokarcinómu - rýchlu stratu totipotencie a nemožnosť ich použitia v klinických skúškach, zatiaľ čo zmiešaná diferenciácia v kultúre veľmi sťažuje izoláciu čistej špecializovanej línie z heterogénnej bunkovej populácie. Preto je zdrojom línií ESC vytvorených na klinické účely zvyčajne vnútorná bunková hmota blastocysty, jednotlivé blastoméry embryí v štádiu 8 buniek, bunky moruly neskorších štádií, ako aj primordiálne zárodočné bunky.

Treba poznamenať, že teratokarcinómové bunky, hoci majú vlastnosť pluripotencie, sa vyznačujú výrazne nižším pluripotentným potenciálom v porovnaní s ESC. Ich integrácia s embryonálnymi bunkami zriedkavo vedie k tvorbe chimér, ktoré navyše nikdy netvoria gaméty s genotypom teratokarcinómových buniek. Predpokladá sa, že je to spôsobené častým výskytom chromozómových abnormalít počas kultivácie teratokarcinómových buniek: strata chromozómu Y, rôzne trizómie, delécie alebo translokácie.

Pokusy o izoláciu línie ľudských embryí (ESC) sa opakovali, ale táto úloha nebola vyriešená, pretože normálne ľudské blastocysty sú ťažko dostupné. Okrem toho je frekvencia chromozómových abnormalít u ľudí vyššia ako pri embryogenéze u zvierat. Prevažná väčšina skorých ľudských embryí získaných po oplodnení in vitro vykazuje chaotickú chromozómovú mozaiku a často má numerické a štrukturálne aberácie. Aj neskôr, v štádiu blastocysty, iba 20 – 25 % ľudských embryí pozostáva z buniek s normálnym karyotypom. Použitie takýchto embryí na vytvorenie ESC bolo prakticky nemožné, pretože zygoty sa zvyčajne kultivovali do štádia dvoch alebo štyroch blastomér a potom sa transplantovali do maternice. Až relatívne nedávno bola vyvinutá spoľahlivá technika kultivácie oplodnených ľudských vajíčok do štádia blastocysty. Zavedenie tejto techniky do praxe oplodnenia in vitro nielenže zvýšilo frekvenciu úspešných implantácií, ale tiež urobilo normálne blastocysty dostupnejším objektom.

Ďalším zdrojom pluripotentných kmeňových buniek sú primordiálne zárodočné bunky, ktoré na rozdiel od pokročilejších progenitorových populácií zárodočného epitelu nemajú na svojom povrchu beta-integrín, ale exprimujú vysokú aktivitu alkalickej fosfatázy. Treba poznamenať, že populácie kmeňových buniek, ktoré vznikli z primordiálnych zárodočných buniek, sa experimentálne študujú od 80. rokov 20. storočia. Vtedy bola vyvinutá technika izolácie primordiálnych zárodočných buniek zo zárodku gonády myšieho embrya. Prvé neúspešné výsledky kultivácie primordiálnych zárodočných buniek in vitro naznačovali márnosť týchto pokusov, pretože bunky síce prežili, ale neproliferovali a uhynuli v priebehu prvého dňa. Neskôr sa zistilo, že myšie primordiálne zárodočné bunky sa in vitro reprodukujú iba v prítomnosti rozpustných a membránovo viazaných špecifických polypeptidových rastových faktorov v kultivačnom médiu. Výsledky mnohých štúdií ukázali, že pre prežitie a proliferáciu primárnych zárodočných buniek je nevyhnutná prítomnosť nielen LIF, ale aj membránovo viazaných a rozpustných Steel faktorov (SIF) v kultivačnom médiu. Tieto peptidy sú produkované somatickými bunkami embryí homozygotných pre Steelovu mutáciu a jeden z nich je ligandom protoonkogénu cKit.

Primárne zárodočné bunky cicavcov a ľudí majú extragonadálny pôvod a sú zdrojom klonálneho vývoja línie zárodočných buniek. Pôvodom primordiálnej línie zárodočných buniek, ako aj všetkých embryonálnych tkanív a extraembryonálneho mezodermu, je epiblast (primárny ektoderm) raných embryí, ktorý má mozaikovú štrukturálnu organizáciu. Pomocou metódy mikrochirurgického odstránenia rôznych častí raného embrya bola v epiblaste stanovená lokalizačná zóna klonu viazaných prekurzorov primordiálnych zárodočných buniek. Pomocou rodamín dextránu, ktorý bol použitý ako bunkový marker, sa zistilo, že prekurzory primordiálnych zárodočných buniek sú lokalizované v proximálnej oblasti epiblastu, v blízkosti extraembryonálneho ektodermu. Primordiálna línia zárodočných buniek vzniká zo 45-bunkového klonu, ktorého alokácia nastáva na samom začiatku gastrulácie. Potom sa klon oddelí a počas gastrulácie vstupujú primárne zárodočné bunky do extraembryonálneho mezodermu a nachádzajú sa na báze rudimentu alantoisu, za primárnym prúžkom. Odtiaľ migrujú primárne zárodočné bunky smerom k ventrálnej časti endodermu zadného čreva a potom sa aktívne pohybujú pozdĺž mezentéria a na konci migrácie osídľujú genitálne hrebene. Počas migrácie, ako aj v prvých 2-3 dňoch lokalizácie v rudimente gonády, sa primárne zárodočné bunky aktívne množia a prechádzajú ôsmimi replikačnými cyklami. Ak je na začiatku migrácie približne 50 primárnych zárodočných buniek, potom v genitálnych hrebeňoch myších embryí dvanásťdňového vývoja počet primárnych zárodočných buniek presahuje 25 000.

Funkčnú podobnosť ESC a primordiálnych zárodočných buniek dokazuje úplná integrácia týchto buniek do blastocysty s nahradením vnútornej bunkovej hmoty a následným plnohodnotným vývojom embrya, ktorého tkanivá pozostávajú iba z potomkov primordiálnych zárodočných buniek. V ďalších vlastnostiach sa myšie primordiálne zárodočné bunky tiež ukázali byť identické s ESC, pričom preukázali schopnosť diferencovať sa v rôznych smeroch, tvoriť embryoidné telieska in vitro a tvoriť teratómy in vivo pri subkutánnom podaní imunodeficientným myšiam, ktoré sa podobajú spontánnym testikulárnym teratómom u myší 129/ter.

Zistilo sa, že keď sa do média pridajú LIF, membránovo viazaný a rozpustný SIF, izolované primárne zárodočné bunky 8-dňových myších embryí prežijú a reprodukujú sa v kultúre 4 dni, ale potom uhynú. Navyše, obdobie, kedy sa v kultúre pozoruje smrť primárnych zárodočných buniek, sa zhoduje so štádiom vývoja myších embryí (12,5 – 13,5 dňa), keď samičie primárne zárodočné bunky vstupujú do meiózy v zárodkoch gonád a mitotické delenie je v samčích primárnych zárodočných bunkách blokované. Ak sa však do média pridajú nielen rastové faktory LIF a SIF, ale aj FGF2, primárne zárodočné bunky sa naďalej množia a v subkultúrach sa tvoria kolónie buniek schopných množenia aj po odstránení rastových faktorov (SIF a FGF) z média. Takéto bunky sa môžu dlhodobo kultivovať na substráte embryonálnych fibroblastov bez pridania rozpustného rastového faktora LIF. Bolo navrhnuté nazývať tieto stabilné bunkové línie získané z primordiálnych zárodočných buniek embryonálnymi zárodočnými bunkami. Tento termín nie je vôbec úspešný, pretože pri kultivácii EG buniek nie je možné získať embryonálne zárodočné bunky schopné vykonávať následné štádiá oogenézy alebo spermatogenézy. Je to spôsobené tým, že EG bunkové línie síce pochádzajú z primordiálnych zárodočných buniek, ale po získaní vlastností embryonálnych pluripotentných kmeňových buniek v kultúre strácajú schopnosť viazať sa na zárodočné línie. Inými slovami, primordiálne zárodočné bunky po kultivácii strácajú vlastnosti prekurzorov gamét a transformujú sa na pluripotentné bunky podobné ESC.

Bolo zistené, že teratómy nevznikajú, keď sú EG bunky zavedené do imunodeficientných myší. Predpokladá sa, že strata schopnosti ľudských EG buniek viesť k vzniku teratómov je spôsobená tým, že tieto línie neboli vytvorené priamo z kultivovaných primárnych zárodočných buniek, ale boli získané z buniek izolovaných z embryoidných teliesok. Preto je možné, že sú potomkami pluripotentných, ale už viazaných buniek.

Treba poznamenať, že medzi EG bunkami a primordiálnymi zárodočnými bunkami existujú zásadné rozdiely. Tie neumožňujú získať chimérické myšie embryá, čo naznačuje nedostatočnú schopnosť primordiálnych zárodočných buniek integrovať sa do vnútornej bunkovej hmoty alebo trofektodermu. Charakteristiky populácie primordiálnych zárodočných buniek sú viac podobné komitovaným líniám somatických buniek neskorších embryí, ktorých zavedenie do blastocysty tiež nevedie k tvorbe chimérických embryí.

Modifikácia techniky kultivácie embryoidných teliesok získaných agregáciou EG buniek umožnila získať ďalšiu populáciu pluripotentných buniek, nazývaných „bunky odvodené z embryoidných teliesok“ (EBD bunky), pomocou selekcie na selektívnych médiách. Schopnosť EBD buniek dlhodobo proliferovať v kultúre umožnila vytvoriť stabilné bunkové línie viazaných buniek. Získali sa klony buniek exprimujúcich širokú škálu mRNA a proteínových markerov špecializovaných buniek. Tento prístup nakoniec dokázal, že ľudské primárne zárodočné bunky sú pluripotentné a in vitro sa diferencujú na rôzne typy buniek: neuróny, neuroglie, cievny endotel, hematopoetické bunky, svalové a endodermálne bunky.

Alternatívne zdroje embryonálnych kmeňových buniek

Alternatívnym zdrojom ľudských ESC línií môžu byť hybridné bunky. Implantácia heterogénneho konštruktu získaného fúziou elektroporáciou somatických buniek ľudského plodu s kravským vajíčkom, z ktorého bol predtým odstránený pronukleus, do maternice pseudogravidných kráv umožňuje získať vnútornú bunkovú hmotu z umelého embrya predimplantačných štádií vývoja. Na tento účel sa v prvej fáze získa blastocysta z kravského vajíčka s transplantovaným jadrom ľudskej bunky.

V druhej fáze sa z blastocysty izoluje embryoblast a z neho sa pomocou Thomsonovej metódy izolujú ESC. Je pozoruhodné, že najlepšie výsledky pri izolácii línií ESC touto metódou sa dosiahli s použitím jadier folikulárnych buniek alebo primárnych zárodočných buniek, ktoré zostávajú v ľudskom tele v stave hibernácie. Je to spôsobené tým, že jadrá ľudských buniek transplantovaných do kravského vajíčka musia mať neskrátené teloméry a vysokú telomeázovú aktivitu, čo pomáha predchádzať predčasnému starnutiu klonov ESC získaných z hybridného vajíčka (Repin, 2001). Je známe, že najdôležitejšie intracelulárne markerové proteíny ESC sú Oct3, Oct4, Tcf, Groucho, ktoré patria medzi tzv. proteíny tlmiace chromatín. Tlmiče poskytujú obzvlášť kompaktné balenie heterochromatínu, ktoré zabraňuje tvorbe euchromatínových slučiek. Balenie chromatínu sprostredkované týmito proteínmi koreluje s totipotenciou genómu ESC. Doteraz sa zistilo, že zrelé hovädzie a ľudské oocyty sú jediným typom špecializovaných buniek, ktoré obsahujú vysoké koncentrácie proteínov tlmičov v cytoplazme. Na tomto základe bola vyvinutá metóda na získanie hybridných ESC prenosom jadier somatických buniek do enukleovaných hovädzích oocytov. Predbežné štúdie in vitro ukázali, že cytoplazma hovädzích oocytov obnovuje totipotenciu genómu ľudských jadier somatických buniek po 12 – 24 hodinách kultivácie.

Obzvlášť zaujímavé sú údaje o zvláštnostiach preimplantačného vývoja ľudských embryí, ktoré naznačujú neskoršiu náhradu totipotentných buniek populáciou pluripotentných buniek ako u myší. Štúdia bunkových transformácií ukázala, že okrem embryonálnych kmeňových buniek vznikajú z buniek vnútornej bunkovej hmoty ľudských blastocyst aj trofoblastové bunky, čo naznačuje ich celkovú účinnosť.

Je známe, že v štádiu blastocysty vznikajú dve odlišne viazané bunkové populácie. Jedna z nich tvorí vonkajšiu vrstvu blastocysty - trofektoderm, ktorého derivátmi sú trofoblastové bunky a ďalšie embryonálne zložky placenty. Druhá populácia buniek je zoskupená do hustej hmoty, ktorá sa dotýka vnútorného povrchu trofektodermu. Deriváty populácie buniek vnútornej bunkovej hmoty sú všetky tkanivá a zárodky orgánov embrya. V štádiu neskorej blastocysty sa z vnútornej bunkovej hmoty tvorí extraembryonálny endoderm a vzniká epiblast (primárny ektoderm). V tomto prípade si epiblastové bunky zachovávajú pluripotenciu, zatiaľ čo schopnosť diferencovať bunky extraembryonálneho endodermu je obmedzená.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Získanie ľudských embryonálnych kmeňových buniek

Až donedávna sa verilo, že je nemožné získať ESC z trofoblastu. Línia diploidných kmeňových buniek trofektodermu izolovaných z blastocysty však proliferuje a transformuje sa na kmeňové bunky v médiu obsahujúcom FGF2 a heparín namiesto LIF. Ak sa FGF2 z média odstráni, bunky trofektodermu sa prestanú množiť, začne sa v nich endoreduplikácia chromozómov a bunkové elementy trofektodermu sa postupne transformujú na obrovské bunky trofoblastu. LIF pravdepodobne nestimuluje proliferáciu buniek trofektodermu, pretože FGF2 spúšťa iný mechanizmus transsignácie, pretože FGF2, ktorý sa viaže na plazmatický receptor (FGFR2), aktivuje MAP kinázy v cytoplazme - ERK1 a ERK2. V dôsledku toho, keď sa v bunkách blastocysty zapne jedna signálna dráha (LIF - gpl30 - JAK kináza - STAT3), bunky vnútornej bunkovej masy sa transformujú na pluripotentné embryonálne kmeňové bunky (ESC) a keď sa aktivuje druhý mechanizmus transmembránovej signálnej transdukcie (FGF2 - FGFR2 - MAP kináza ERK1/ERK2), v blastocyste sa tvoria trofektodermálne kmeňové bunky. Výber signálnej dráhy zase závisí od aktivity génu oct4. Tento gén, ktorý patrí do domény POU, sa nachádza v lokuse t autozómu 17 a je exprimovaný počas oogenézy, počas obdobia štiepenia, ako aj v bunkách vnútornej bunkovej masy blastocysty a v primárnych zárodočných bunkách. Funkčnou úlohou génu oct4 je kódovať transkripčný faktor potrebný pre vznik pluripotentných buniek, ich diferenciáciu a dediferenciáciu.

Expresia génu oct4 v embryonálnych kmeňových bunkách (ESC) sa líši v závislosti od interakcie tohto transkripčného faktora s kofaktormi. Riadená regulácia expresie oct4 v blastocystách ukázala, že keď je jeho aktivita znížená, polovica buniek tvorí trofektoderm, zatiaľ čo keď sa indukovaná expresia oct4 zvýši, vznikajú prevažne ESC.

V experimente nie je možné preniesť ESC do línie počas kultivácie totipotentných blastomér v štádiu štiepenia, ako aj v štádiu gastrulácie a neskorších štádiách embryonálneho vývoja. Myšie ESC sa zvyčajne izolujú na 3,5-4,5 deň tehotenstva, čo zodpovedá šiestemu (jednovrstvová blastocysta) a siedmemu štádiu (dvojvrstvová blastocysta - skorý vaječný valec) normálnej embryogenézy. Je zrejmé, že iba v preimplantačnom období obsahujú myšie embryá bunkové populácie schopné transformácie na ESC. V dôsledku toho je izolácia línií ESC možná iba v určitých štádiách embryogenézy. Zygota a blastoméry vznikajúce počas štiepenia sú totipotentné z hľadiska možnosti vývoja životaschopného embrya s embryonálnymi membránami a placentou. Strata celkovej potencie zárodočných buniek začína v neskorom štádiu moruly, keď ďalšie uchytenie blastomér závisí od ich umiestnenia. Skoré blastoméry moruly si zachovávajú totipotenciu, pretože experimentálne manipulácie so zmenami v ich lokalizácii, ako je inverzia ich umiestnenia, nebránia vývoju plnohodnotného embrya.

Bolo zistené, že účinnosť izolácie embryonálnych kmeňových buniek (ESC) do línie je ovplyvnená stavom blastocýst v čase ich explantácie. Použitie blastocýst po modelovaní sedemdňovej diapauzy v reprodukčnom trakte myší, ktorým bola vykonaná ovariektómia na 3,5. deň gravidity a ktorým bol podaný progesterón, uľahčuje úspešnejšiu izoláciu embryonálnych kmeňových bunkových línií. Predpokladá sa, že za takýchto podmienok sa zvyšuje počet blastomérov tvoriacich vnútornú bunkovú hmotu. Je tiež možné, že bunkový cyklus sa predĺži a väčšina blastomér vstúpi do fázy G0.

Okrem toho, vytvorenie stabilných pluripotentných línií ESC závisí od genotypu embryí: ESC sa pomerne ľahko izolujú z blastocyst myšej línie 129, je oveľa ťažšie ich získať pomocou myší CS7BL/6 a je prakticky nemožné izolovať líniu ESC z blastocyst myší CBA/Ca. Je zrejmé, že skoré embryá majú niektoré genetické vlastnosti, ktoré ovplyvňujú vývoj pluripotentnej línie ESC. Napriek tomu, pri kultivácii izolovaných epiblastov, ako aj selektívnou selekciou diferenciačných buniek, boli línie ESC izolované z skorých embryí myší CBA/Ca.

Osvedčená štandardná technika na získanie ESC línií z blastocyst je uvedená v laboratórnych manuáloch o technike experimentov s skorými embryami. Experimentálne ESC línie je možné získať aj kultiváciou izolovaného epiblastu (primárneho ektodermu) 4,5-dňových myších embryí pomocou pomerne zložitej mikrochirurgickej techniky a modifikovaných kultivačných podmienok. Prácnosť tohto postupu je opodstatnená, pretože frekvencia tvorby ESC línií sa v tomto prípade ukázala byť výrazne vyššia ako pri prácach s vnútornou bunkovou hmotou blastocysty.

Na izoláciu línií ESC sa každý klon prenesie do mikrojamky, vypestuje sa agregát 40 – 60 buniek a potom sa opäť dispergujú. Viacnásobné opakovania tohto postupu nám umožňujú získať imortalizovanú líniu ESC s maximálnou mierou proliferácie normokaryotypických buniek pripojených k plastu, ktoré si po 50 – 100 pasážach zachovávajú totipotenciu a vysokú telomerázovú aktivitu. V procese udržiavania línií ESC je najväčším nebezpečenstvom kontaminácia média alebo séra bakteriálnymi endotoxínmi – aj stopové koncentrácie endotoxínu v kultivačnom médiu spôsobujú hromadnú smrť nezrelých zárodočných buniek. Pri starostlivom monitorovaní lineárneho rastu a včasnej disperzii sú ESC v kultúre schopné symetrického delenia, pri ktorom obe dcérske bunky zostávajú pluripotentné a schopné vykonávať neobmedzený počet bunkových cyklov, pričom si zachovávajú diploidný karyotyp a celkovú potenciu.

Selekciu čistej populácie ľudských ESC je možné vykonať po transfekcii ich genómu rekombinantnými molekulami DNA obsahujúcimi gén kódujúci syntézu zeleného fluorescenčného proteínu (GFP). Expresia GFP sa zvyšuje, keď sa ESC pestujú v podmienkach, ktoré podporujú ich proliferáciu, zatiaľ čo s nástupom diferenciácie sa hladina expresie tohto génu znižuje, čo umožňuje selekciu čistých stabilných pluripotentných bunkových línií na selektívnom médiu. Pri kultivácii ESC izolovaných pomocou selekcie GFP sa frekvencia tvorby kolónií mnohonásobne zvyšuje, pretože silný antiproliferačný účinok diferencovaných buniek je v podmienkach selekčných kultúr eliminovaný.

Translácia ľudských embryonálnych kmeňových buniek do línie sa vykonáva metódou ich izolácie z preimplantačných embryí (v štádiu 80 – 120 buniek), ktoré zostávajú po oplodnení in vitro. Na tento účel sa umelo získané „prebytočné“ embryá mechanicky dispergujú v Delbeccovom-Eagleovom médiu. Po označení buniek selektívnymi monoklonálnymi protilátkami s fluorescenčnou značkou sa izolujú embryoblastové bunky. Embryoblast sa disperguje do jednotlivých buniek pomocou zmesi dispázy a kolagenázy. Disociované bunky sa pestujú v špeciálnom médiu (80 % Delbeccovo médium + 20 % fetálne teľacie sérum v prítomnosti 500 μg/ml IL-6, LIF a SCF) cez podkladovú monovrstvu embryonálnych fibroblastov z prvých 3 pasáží. V tomto prípade sa prežitie a proliferácia kmeňových a progenitorových buniek zachováva vďaka účinku IL-6, LIF a SCF. V takomto médiu rastú ESC ako suspenzné klony nepripojených zhluknutých buniek, ktoré sa musia disociovať jemným, opakovaným pipetovaním. Nové klony sa v suspendovanej kultúre objavujú 5. až 7. deň. Maximálna rýchlosť rastu ESC sa dosahuje opakovanou disociáciou klonov v štádiu 10 – 15 buniek. Potom sa každý klon prenesie do mikrojamky a pestuje sa do agregátu 40 – 50 buniek. Postup sa v pasážach mnohokrát opakuje, čím sa objem kultúry zvyšuje na hustotu 5 – 10 miliónov buniek na 6 cm misku. Pomocou takéhoto pasážovania Thomson izoloval 10 nesmrteľných klonov ľudských ESC, ktoré si po 100 pasážach zachovali vysokú telomerázovú aktivitu, schopnosť bujného množenia, minimálne fenotypové charakteristiky a celkovú účinnosť so schopnosťou diferencovať sa na ktorúkoľvek z 350 špecializovaných bunkových línií odvodených z ekto-, mezo- a endodermu. Diferenciácia ľudských ESC začala (po zmene média, pridaní séra a eliminácii LIF) prichytením buniek k substrátu, čo naznačuje vývoj cytoskeletu a expresiu adhéznych receptorov. Dôležité je, že pri neobmedzenej proliferácii si ľudské ESC zachovali normálny karyotyp.

Druhá metóda izolácie ľudských ESC línií je založená na použití primárnych zárodočných buniek. Experimentálne štúdie ukázali, že E bunkové línie je možné získať z genitálnych záhybov 12,5-dňových myších embryí. V týchto prípadoch však bola frekvencia tvorby progenitorových bunkových línií výrazne nižšia ako v experimentoch so skoršími embryami. Zároveň primárne zárodočné bunky z gonád myších embryí s 13,5-dňovým gestačným vekom nie sú vôbec schopné transformácie na línie.

Prvé stabilné línie pluripotentných ľudských EG buniek boli získané z primárnych gonocytov izolovaných z gonád 5-9 týždňov starých embryí. Izolované bunky boli kultivované na substráte inaktivovaných myších embryonálnych fibroblastov v médiu DMEM s fetálnym sérom doplneným o merkaptoetanol, forskolín a rekombinantné ľudské rastové faktory (FGF a LIF). Po 7-12 dňoch sa v kultúre objavili mnohobunkové kolónie, ktoré morfologickými znakmi a molekulárnymi markermi zodpovedali ľudským EG bunkám. Po agregácii tieto bunky vytvorili embryoidné telieska, s ďalším vývojom ktorých sa objavili špecializované bunky charakteristické pre deriváty všetkých troch zárodočných vrstiev. V priebehu 10-20 pasáží si EG bunkové línie zachovali normálny karyotyp a nestratili pluripotenciu.

Bolo tiež preukázané, že kombinovaný účinok LIF, membránovo viazaných a rozpustných Steel faktorov a TGF-β mení vývojový program primordiálnych zárodočných buniek. Namiesto toho, aby sa primordiálne zárodočné bunky zastavili v mitotickom delení a začali sa diferencovať smerom k oogenéze alebo spermatogenéze, pokračujú v proliferácii. Po niekoľkých ďalších mitotických cykloch sa stanú podobnými epiblastovým bunkám a strácajú vlastnosti prekurzorov zárodočných buniek a transformujú sa na pluripotentné embryonálne kmeňové EG bunky.

V roku 1998 boli teda z genitálneho rudimentu tkaniva pitvy ľudského plodu prvýkrát izolované imortalizované línie primordiálnych zárodočných buniek. V ľudskej embryogenéze sa primordiálne zárodočné bunky objavujú v žĺtkovom vaku v 3. týždni vývoja a v 4. – 5. týždni tieto bunky migrujú do zóny genitálneho tuberkulu, kde tvoria dormantné populácie primárnych gonocytov. V neaktívnom stave sa primordiálne zárodočné bunky v embryu uchovávajú až do narodenia. Línie primordiálnych zárodočných buniek sa izolujú z fetálneho genitálneho tuberkulu 5. – 9. týždňa starých embryí, ktorých extrahované tkanivo sa ex tempore ošetrí zmesou kolagenáz typu IV – V, hyaluronidázy a DNázy, aby sa zvýšil kvantitatívny a kvalitatívny výťažok buniek. Primordiálne zárodočné bunky v tkanive fetálneho genitálneho tuberkulu sú obklopené stromálnymi (mezenchymálnymi) Sertoliho bunkami. Funkčným účelom Sertoliho buniek je produkcia antiapoptotických faktorov (Fas ligand), mitogénov a imunosupresív, ktoré chránia zárodočné bunky pred imunitným útokom tela. Okrem toho, stromálne mikroprostredie genitálneho tuberkulu zohráva dôležitú úlohu pri dozrievaní gamét. Izolované primárne zárodočné bunky sa vysádzajú v kultúre na výživnú stromálnu vrstvu pozostávajúcu z fetálnych fibroblastov z prvých troch pasáží. Najúčinnejšou kombináciou mitogénov je komplex pozostávajúci z LIF, FGF a forskolínu (stimulátor tvorby cAMP). Proliferácia primárnych zárodočných buniek in vitro vyžaduje pridanie fetálneho séra, v prítomnosti ktorého je reprodukcia primárnych gonocytov v kultúre sprevádzaná tvorbou klonov sférických buniek, ktoré nie sú pripojené k substrátu.

V Národných inštitútoch zdravia USA sa na základe súhrnu existujúcich údajov o metódach izolácie línií ľudských embryonálnych kmeňových buniek (ESC) z blastocyst dospelo k predbežnému záveru, že úspešná izolácia ESC je najpravdepodobnejšia pri kultivácii blastocyst s dobre vytvorenou vnútornou bunkovou hmotou (Kmeňové bunky: vedecký pokrok a budúce smery výskumu. Národný inštitút zdravia USA). Z tohto hľadiska je optimálnym zdrojom ESC pre tvorbu línií ľudské blastocysty na 5. deň vývoja, z ktorých by sa mal pri izolácii vnútornej bunkovej hmoty starostlivo odstrániť trofektoderm. Izolovaná vnútorná bunková hmota, pozostávajúca v tomto štádiu z 30 – 35 buniek, by sa mala kultivovať na substráte embryonálnych myších fibroblastov, čo je rozhodujúcou podmienkou pre tvorbu kolónií ESC v kultúre.

Analýza fenotypových znakov embryonálnych kmeňových buniek

Obzvlášť zaujímavá je medzidruhová porovnávacia analýza fenotypových znakov embryonálnych kmeňových buniek (ESC). Zistilo sa, že ľudské ESC kolónie sú husté zhluky sploštených buniek podobných epitelu, zatiaľ čo telá myších embryí pozostávajú z voľného konglomerátu zaoblených buniek. V ľudských ESC je index pomeru jadra a plazmy nižší ako v myších ESC. Embryonálne kmeňové bunky opíc tvoria plochejšie kolónie buniek s nerovnými okrajmi. Jednotlivé bunky sú ľahko viditeľné v skorých klonoch ESC primátov. Proliferujúce ESC všetkých študovaných druhov zvierat neexprimujú molekuly MHC triedy I a II. Zároveň ľudské ESC reagujú pozitívne na protilátky TERA 1-60 a GCTM-2, čo naznačuje prítomnosť proteoglykánov keratín/chondroitínsulfátu na ich povrchu, charakteristických pre kmeňové bunky embryo-(terato)-karcinómu. Expresia génu oct4 v ESC všetkých druhov zvierat naznačuje, že napriek fenotypovým rozdielom je v ľudských a myších ESC zrejme aktivovaná rovnaká sada génov zodpovedných za udržanie pluripotencie (Peru, 2001). Okrem toho, ESC línie izolované z embryí potkanov, ošípaných, králikov, primátov a hovädzieho dobytka majú podobné morfologické charakteristiky, podobný súbor molekulárnych identifikačných markerov a takmer identický molekulárny mechanizmus pre implementáciu programov embryogenézy, čo nám umožňuje nový pohľad na problém xenotransplantácie.

Na rozdiel od normálnej embryogenézy in vivo, proliferácia embryonálnych kmeňových buniek (ESC) in vitro nie je sprevádzaná tvorbou zárodočných vrstiev a prebieha na pozadí blokovania homeotických Hoxgénov, t. j. bez organogenézy. Keďže segmentačné gény nefungujú, nie je možné v kultúre ESC reprodukovať také obdobia embryogenézy, ako je kladenie somitov, segmentácia embrya, tvorba žĺtkového vaku, alantoisu a iných provizórnych orgánov a tkanív. Zdá sa, že kultivované ESC zamrzli na začiatku procesu tvorby 350 reštrikčných línií špecializovaných buniek. Klon dcérskych progenitorových buniek a centrálne lokalizovaná ESC teda predstavujú iba model embrya, počas ktorého vývoja sa súčasne tvoria rôzne línie špecializovaných buniek v rôznych oblastiach tkaniva, ktoré však pochádzajú zo spoločných prekurzorov. Napriek minimálnej hladine receptorov na povrchu ESC si zachovávajú schopnosť vykonávať primitívne morfogenetické procesy, ktoré napodobňujú objemové štruktúry skorého embrya: suspenzia ESC v kultúre sa agreguje a vytvára štruktúry pripomínajúce blastocysty alebo dokonca neskoršie embryá (vajíčkové valce). Takéto suspenzné agregáty sa nazývajú jednoduché a komplexné embryoidné telieska.

Pri zmiešanej diferenciácii sú skoré gény ektodermu (oct3, fgf-5, nodal), endodermu (gata-4), mezodermu (brachyury), kardiogénneho mezodermu (pkh-2.5), neurálnej trubice (msx3) a hematopoézy (elkf) súčasne exprimované v rôznych bunkách jedného embryoidného telieska. Použitím rôznych kombinácií rastových faktorov a cytokínov pre cielené pôsobenie na tvorbu buniek zárodočnej vrstvy in vitro bolo v mnohých prípadoch možné získať embryoidné telieska, v ktorých boli prednostne exprimované gény ektodermu alebo mezodermu, čo otvára cestu k modelovaniu gastrulácie a počiatočných fáz organogenézy.

Klonálny rast ESC je dôkazom asymetrického bunkového delenia, pri ktorom si iba jedna ESC v strede klonu zachováva neobmedzený proliferačný potenciál, zatiaľ čo druhá dcérska bunka generuje generáciu progenitorových buniek, ktoré už prechádzajú diferenciáciou. Preto je rýchlosť proliferácie klonov na periférii embryoidného tela vyššia ako v strede. Okrajové bunky rastúceho klonu prechádzajú spontánnou neusporiadanou diferenciáciou, migrujú alebo odumierajú apoptotickými mechanizmami. Tieto udalosti určujú osud klonu: ak rýchlosť proliferácie prekročí rýchlosť migrácie a apoptotickej bunkovej smrti, klon sa naďalej zväčšuje, stabilizácia nastáva, keď je rýchlosť apoptózy a rýchlosť tvorby nových buniek rovnaká, a regresia nastáva, keď je pomer týchto procesov inverzný. Progenitorové bunky sa delia symetricky, t. j. obe dcérske bunky sa následne diferencujú na zrelé špecializované bunkové línie. Pomer ESC k progenitorovým bunkám sa mení, ale počet ESC je vždy len zlomkom percenta populácie progenitorových buniek. Preto iba starostlivé pipetovanie a včasná disagregácia klonov môže zvýšiť počet ESC v kultúre. Disagregácia klonov v štádiu 10-12 buniek sa ukázala ako najúčinnejšia na dosiahnutie maximálneho výťažku ESC. Smer a stupeň diferenciácie buniek v embryoidnom tele závisia od ich umiestnenia. Vonkajšie bunky embryoidného tela neexprimujú gén oct4 a podliehajú diferenciácii na bunky primárneho endodermu, z ktorých sa následne tvoria epitelové bunky parietálneho a viscerálneho extraembryonálneho endodermu. Vnútorné bunky embryoidného tela exprimujú gén oct4 a zachovávajú si pluripotenciu počas 48 hodín kultivácie. Kultúra sa však potom morfologicky reštrukturalizuje do epitelovej monovrstvy a začína sa expresia génov riadiacich vývoj primárneho ektodermu. Následne začína proces úplnej neusporiadanej cytodiferenciácie s výskytom rôznych typov buniek, ktoré sú derivátmi všetkých troch zárodočných vrstiev. V procese spontánnej diferenciácie buniek embryoidného tela sa ako prvé objavujú agregáty s endodermálnymi markermi vo forme fragmentov (cyst) žĺtkového vaku. V týchto štruktúrach sa potom objavujú angioblasty a endotelové bunky rastúcich kapilár. V záverečných štádiách spontánnej diferenciácie sa z vnútorných buniek embryoidného tela vyvíjajú rôzne terminálne diferencované bunky vrátane neurónov, gliových elementov, kardiomyocytov, makrofágov a erytrocytov. Do určitej miery (berúc do úvahy priestorovú inverziu tvorby vrstiev zárodočného tkaniva) je možné pomocou embryoidných teliesok študovať morfogenetické procesy in vitro a analyzovať molekulárne mechanizmy počiatočných období embryonálnej cytodiferenciácie.ako aj stanoviť úlohu špecifických génov pri realizácii týchto procesov.

V rámci klonu sa teda nachádzajú bunky, v ktorých boli objavené rôzne genetické vývojové programy - ESC, skoré progenitory a diferencujúce sa progenitorové populácie. Kultivácia ESC metódou zavesenej kvapky alebo masovej kultúry bez podpôrnej vrstvy a bez pridania LIF do média nevyhnutne vedie k tvorbe embryoidných teliesok. Morfológia buniek vonkajšej a vnútornej vrstvy embryoidných teliesok sa líši. Vonkajšia vrstva pozostáva z veľkých, rozvetvených buniek. Ich povrch otočený do prostredia je pokrytý početnými mikroklkami. Vonkajšia vrstva buniek je od vnútornej vrstvy oddelená bazálnou membránou pripomínajúcou Reichertovu membránu, zatiaľ čo bunky vnútornej vrstvy embryoidných teliesok sú tvorené stĺpcovým epitelom. Morfologicky sa vnútorná vrstva, hoci obsahuje veľa deliacich sa buniek, viac podobá nediferencovaným kolóniám ESC.

Charakteristiky ľudských embryonálnych kmeňových buniek

Absencia parenchymatózno-mezenchymálnych signálnych interakcií na pozadí blokovania génov homeózy vedie k narušenému rastu embryonálnych kmeňových buniek (ESC) v kultúre, pretože to narúša tvorbu a vývoj infraštruktúry provizórnych orgánov. Neorganizovaný rast a narušená spontánna diferenciácia ESC v kultúre sú spôsobené absenciou mezenchymálneho značenia stromálnej štruktúry budúcich orgánov: in vitro je celkom možné vytvoriť milióny hepatocytov, ale nie je možné získať jediný pečeňový lalok, ktorý by obsahoval také štrukturálne a funkčné prvky, ako sú dutiny, Disseho priestory a Kupfferove bunky.

Predpokladá sa, že pluripotencia embryonálnych kmeňových buniek (ESC) sa realizuje výlučne v embryogenéze s tvorbou tkanív a orgánov embrya, zatiaľ čo placenta a pupočná šnúra sú derivátmi trofoblastu. ESC uzavreté v trofektodermálnej membráne postupne generujú klony provizórnych buniek, ktoré implementujú vývojový program prostredníctvom kombinatorickej mRNA volumetrickej topografickej matrice Nochteyova, ktorá predurčuje priestorové usporiadanie, tvar a veľkosť, počet buniek provizórnych a definitívnych orgánov, ako aj zostavenie parenchýmu do štrukturálnych a funkčných jednotiek. Zároveň ESC zostávajú jediným typom buniek, v ktorých je molekulárny mechanizmus implementácie ich potenciálov úplne odpojený od genetického vývojového programu a samotné ESC sú zbavené schopnosti interagovať s inými bunkami v dôsledku blokovania receptorového vnímania aj transsignálnych systémov. Adekvátna aktivácia ESC však vedie k postupnému vývoju embryogenézneho programu, ktorý končí zrodom plne sformovaného organizmu pozostávajúceho z miliárd buniek, pripraveného na mimomaternicový život. Na tejto krátkodobej, ale nepredstaviteľne dlhodobej ceste v bunkovom priestore nevyhnutne vznikajú chyby tak v molekulárnych mechanizmoch, ktoré zabezpečujú životne dôležitú činnosť buniek, ako aj v programoch, ktoré riadia ich proliferáciu, diferenciáciu a špecializáciu. Preto sa v modernej farmakogenomike ochorenia molekulárnej štruktúry a ochorenia bunkového programovania posudzujú samostatne. Navyše, účinok väčšiny nových liekov je zameraný na korekciu programov diferenciácie, proliferácie a organogenézy, ako aj na regeneráciu orgánov a tkanív. V dospelom organizme umožňujú ESC kontrolovať správanie kmeňových/progenitorových buniek transplantovaných do mozgu, pečene, sleziny, kostnej drene a iných ľudských orgánov s cieľom obnoviť poškodený parenchým orgánov príjemcu diferenciáciou a špecializáciou darcovských buniek na zachovanej mezenchymálnej matrici. V podstate sa program totipotencie začína realizovať na úrovni genómov oocytov, zygot a blastomér; tieto bunky však ešte neboli klonované a pasážované v množstvách potrebných pre potreby experimentálnej a praktickej medicíny. ESC preto zostávajú jedinečným zdrojom genetických informácií obsahujúcich kódy pre trojrozmernú mapu embrya a kódy pre lineárne obmedzenie špecializovaných bunkových línií počas gastrulácie.

Prakticky neobmedzený regeneračný potenciál embryonálnych kmeňových buniek (ESC) je spôsobený tým, že ich genóm si na rozdiel od genetického aparátu diferencovaných somatických buniek zachováva pluripotenciu. Jedným z prejavov dormantného stavu genetickej informácie obsiahnutej v ESC je tzv. minimálny fenotyp - na povrchu ESC sa exprimuje obmedzený počet receptorov, a preto je na interakciu jadrového aparátu bunky s jej mikroprostredím nasadených len veľmi málo transsignálnych programov. Na pozadí hibernácie génov zodpovedných za obmedzenie špecializovaných bunkových línií a diferenciáciu buniek sa aktivuje iba približne 30 z 500 génov, ktorých produkty zabezpečujú spojenie bunky s okolitým mikroprostredím. Pomocou metódy sériovej analýzy génovej expresie sa ukázalo, že pri spoločnej práci hlavných funkčných boxov genómu regulujúcich energetiku a metabolizmus v somatických bunkách a ESC majú tieto veľmi nízku hladinu mRNA receptorov, G proteínov, sekundárnych poslov, transkriptáz, kofaktorov expresie a represie, t. j. celého systému transmembránového prenosu regulačného signálu do bunky. Je to spôsobené absenciou alebo veľmi nízkou expresiou transsignálnych génov. Počas obdobia indukovanej diferenciácie v genóme ESC synchrónne prestane fungovať 18 funkčných génov na pozadí aktivácie 61 transsignálnych génov riadiacich syntézu receptorov bunkovej adhézie, zložiek extracelulárnej matrice, reštrikčných transkriptáz a messengerových prvkov systému prenosu signálu do jadrového aparátu z receptorov bunkovej plazmatickej membrány. Súčasne je blokovaná expresia génov zodpovedných za syntézu silencerových proteínov, ako aj koinhibítorov génovej expresie, ktoré zabezpečujú totipotenciu genómu ESC.

Génové markery boli nájdené pre bunky všetkých troch zárodočných vrstiev. Identifikácia ektodermálnej bunkovej vrstvy sa vykonáva expresiou génov nodal, oct3 a fgf-5, mezodermálnych buniek - génmi brachyury, zeta-globínu, endodermu - expresiou génu gata-4. Pri normálnej embryogenéze počas gastrulačného obdobia sa pozoruje aktívna migrácia nezrelých populácií kmeňových a progenitorových buniek, ktoré lokálne označujú vývojové zóny tvárových kostí lebky, niektorých častí mozgu, periférneho nervového systému, srdcového vodivého systému a týmusu, ktorých tkanivá sú tvorené z klonov migrujúcich buniek. Značenie buniek skorými génmi zárodočných vrstiev uľahčuje topografickú analýzu procesov migrácie prekurzorových buniek vo vyvíjajúcom sa embryu. Bolo zistené najmä to, že v agregátoch buniek embryokarcinómu P19 začína expresia prvého mezodermálneho génu brachyúria počas obdobia zníženej expresie génov tkanivového aktivátora plazminogénu, a-fetoproteínu, keratínu 8 a keratínu 19, ktoré sú markermi prvých migrujúcich mezodermálnych populácií. V dôsledku toho sa tvorba tkanív mezodermálneho pôvodu začína až po ukončení procesu bodovej migrácie a rozptýlenia mezodermálnych progenitorových buniek.

Napriek extrémne obmedzeným fenotypovým vlastnostiam a absencii väčšiny trans-signálnych jednotiek, ESC stále exprimujú niektoré receptorové molekuly, ktoré možno použiť na ich identifikáciu. Je pozoruhodné, že markerové antigény ESC u ľudí a primátov sa ukázali byť bežné. Najčastejšie sa na značenie ESC používajú značené protilátky proti membránovo viazaným antigénom SSEA-3, SSEA-4 (jedinečné lipidové antigény predstavujúce komplex glykolipidu GL7 s kyselinou sialovou), ako aj vysokopolymérne glykoproteíny TRA-1-81, TRA-1-60. Okrem toho ESC exprimujú špecifický embryonálny antigén SSEA-1 a endogénnu alkalickú fosfatázu, ako aj špecifický transkripčný faktor Oct4. Ten je nevyhnutný pre udržanie mechanizmov proliferácie ESC - špecifický transkripčný faktor Oct4 aktivuje expresiu génu fibroblastového rastového faktora 4 a stabilizuje expresiu boxu génov zodpovedných za neobmedzenú replikáciu DNA v nezrelých bunkách. Najdôležitejšie intracelulárne markerové proteíny sú Oct3, Oct4, Tcf a Groucho, ktoré súvisia s proteínmi tlmiacimi chromatín.

Takmer okamžite po mnohých rokoch úspešných pokusov o kultiváciu embryonálnych kmeňových buniek (ESC) mimo tela a získaní prvých kultúr kmeňových buniek izolovaných z myších blastocyst a kultúr primárnych zárodočných buniek sa začala fáza výskumu pluripotentného potenciálu ESC, keď boli zavedené do embryí v raných štádiách vývoja. Ukázalo sa, že v štádiách moruly a blastocysty sú ESC schopné tvoriť chimérické embryá, v ktorých sú potomkovia darcovských ESC detegovaní vo všetkých somatických tkanivách a dokonca aj v gamétach. Vo vývojovej biológii sa tak pomocou ESC vytvoril „most“ medzi experimentálnymi štúdiami in vivo a in vitro, čo výrazne rozšírilo možnosti štúdia procesov tvorby primárnych tkanív a orgánov, ich diferenciácie a embryonálnej organogenézy.

Je jasne preukázané, že in vivo počas embryogenézy sú ESC integrované do bunkovej hmoty raného embrya a ich deriváty sa nachádzajú vo všetkých orgánoch a tkanivách. ESC kolonizujú líniu zárodočných buniek v chimerickom embryu, ktorého potomkovia tvoria plnohodnotné vajíčka a spermie. Embryonálne kmeňové bunky sú klonogénne - jedna ESC je schopná vytvoriť geneticky identickú kolóniu buniek s molekulárnymi markermi, medzi ktoré patrí expresia génu oct4 a alkalickej fosfatázy, vysoká aktivita telomerázy a expresia určitých embryonálnych antigénov.

Na štúdium mechanizmov embryogenézy pomocou ESC bola vyvinutá metóda chimerizácie moruly vytvorením biologického konštruktu, mimo ktorého sa nachádza vrstva tetraploidných blastomér príjemcu a dovnútra sú zavedené ESC darcu. Z potomkov tetraploidných blastomér príjemcu sa tak vytvorí trofoblast, ktorý zabezpečuje implantáciu a placentáciu, a ESC darcu fungujú ako vnútorná bunková masa, z ktorej sa tvorí telo životaschopného embrya a línia primárnych progenitorových zárodočných buniek. Výskumná hodnota ESC spočíva nielen v tom, že sa počas in vitro manipulácií s ich genómom zachováva pluripotencia, ale aj v tom, že sa zachováva schopnosť ESC podieľať sa na tvorbe primárnych zárodočných buniek chimérického embrya. Ukázalo sa, že potomkovia iba jednej geneticky modifikovanej ESC osídľujú všetky primárne rudimenty a vyvíjajúce sa tkanivá chimérického embrya získaného agregáciou alebo kokultiváciou tejto bunky s 8-bunkovým embryom. Keď boli ESC transfekované génom zeleného fluorescenčného proteínu transplantované do moruly myší, fluorescenční potomkovia tejto bunky boli nájdení vo všetkých študovaných tkanivách vyvíjajúceho sa embrya (Shimada, 1999). Transplantácia ESC do moruly umožňuje vytvorenie životaschopných myší, ktorých organizmus pozostáva iba z potomkov darcovskej ESC, čo otvára perspektívy pre rôzne možnosti terapeutického klonovania. Tento metodologický prístup sa v súčasnosti úspešne používa na štúdium problémov vývojovej biológie, najmä na analýzu mechanizmov genetickej inaktivácie chromozómu X alebo epigenetickej nestability ESC. Transplantácia ESC do skorého embrya sa používa aj v poľnohospodárskej biotechnológii, ako aj v experimentoch génovej terapie.

Transplantácia geneticky modifikovaných ESC sa používa na testovanie cieľových buniek mutantných génov. ESC kultivované in vitro sa používajú v biotechnológii na vytvorenie knockout myší. Na tento účel sa študovaný gén odstráni z ESC homológnou rekombináciou (knockout) a bunky, ktorým tento gén chýba, sa izolujú na selektívnom médiu. Knockout ESC sa potom zavedú do blastocysty alebo sa agregujú s blastomérami moruly. Chimérické skoré embryá získané týmto spôsobom sa transplantujú do recipientných samíc a z novonarodených myší sa vyberú jedince s gamétami nulizygotnými pre daný gén. Táto technológia sa použila na vytvorenie mnohých línií knockout myší, ktoré sa široko používajú v experimentálnej biológii a experimentálnej medicíne. Takéto biologické modely sa používajú na štúdium významu určitých génov v embryonálnom vývoji, ako aj ich úlohy v mechanizmoch ľudských ochorení a patologických stavov. Okrem toho sa knockout zvieracie línie používajú v predklinickom testovaní nových metód génovej terapie. Napríklad transfekciou normálnej alely mutantného génu do genómu ESC je možné účinne korigovať mutáciu ovplyvňujúcu hematopoetický systém. Zavedenie cudzích génov do ESC umožňuje rýchle vytváranie línií homozygotných transgénnych laboratórnych zvierat. Treba však poznamenať, že technika cielenej rekombinácie génovej delécie bola doteraz spoľahlivo vyvinutá iba vo vzťahu k myším ESC. Pomocou dvojito knockoutovaných myších ESC bola stanovená funkčná úloha oblasti génového klastra na chromozóme 7 (kópia genómovej oblasti na ľudskom chromozóme 19) a proximálnej oblasti chromozómu 11 (kópia ľudského chromozómu 5g) - delécia týchto génov v myších ESC umožnila vyhodnotiť funkciu ich analógov u ľudí.

Rozšírili sa možnosti štúdia funkcie génov ľudskej embryogenézy, ktorých transfekcia do genómu ESC laboratórnych zvierat umožnila najmä objasniť úlohu kryptogénu pri tvorbe a vývoji kardiogénneho mezodermu, génu pax-6 - v embryogenéze oka. Zostavujú sa prvé mapy génovej expresie v nezrelých proliferujúcich ESC teratokarcinómu a blastocyst myší a potvrdila sa supresívna represia transsignálnych génov v ESC. Kombinácia 60-80 mutantných ESC a 20-30 buniek normálnych preimplantačných myších embryí vedie k vývoju chimérických embryí, v ktorých orgánové primordie pozostávajú z darcovských a recipientných buniek, čo umožňuje objasniť úlohu neznámych génov v gastrulácii a organogenéze. Funkčná mapa génov vyvíjajúcich sa myších embryí bola doplnená informáciami o úlohe génu sf-1 pri tvorbe nadobličiek a pohlavných žliaz, génu wt-1 pri tvorbe obličiek, génov rodiny myoD pri tvorbe kostrového svalstva a génov rodiny gata-1-4 pri reštrikčnej maturácii základov erytropoézy a lymfopoézy.

Riadené vypínanie materských a otcovských alel génov v ESC pomocou vektorových rekombináz umožnilo objasniť funkcie rôznych génov v ranom období embryogenézy a technológia riadeného prenosu neznámych ľudských génov do myších ESC prispieva k objavu nových mutantných génov zodpovedných za rozvoj závažnej dedičnej patológie. Pomocou metódy knockout bol stanovený obligátorský význam niektorých génov pre tvorbu embryonálnych tkanív: gata-4 - pre myokard, gata-1 - pre erytroidnú líniu hematopoetického tkaniva, myoD - pre kostrové svaly, brachyúria - pre mezoderm, reštrikčné transkriptázy hnf3 a hnf4 - pre pečeňové kmeňové bunky, rag-2 - pre tvorbu klonov T- a B-lymfocytov (Repin, 2001). Dvojitá delécia génov v ESC otvorila prístup k štúdiu funkčnej úlohy génov zárodočnej vrstvy, segmentácie a homeózy a transplantácia ESC umožnila získať životaschopné medzidruhové hybridné embryá. Pomocou vylepšenej techniky transplantácie ESC od jedného darcu do 8-bunkového embrya sa preukázala skutočnosť chimerizácie na bunkovej úrovni mnohých orgánov recipientného embrya. Treba poznamenať, že po zavedení ľudských hematopoetických kmeňových buniek do blastocysty sa v orgánoch recipientných myší našli bunkové klíčky ľudského tkaniva. Bolo zistené, že pluripotentné ESC cirkulujú v krvi myších embryí počas obdobia tvorby orgánov. Je možné, že ich biologická funkcia spočíva v embryonálnej organizácii budúceho imunitného systému. S pomocou ESC sa v laboratórnych podmienkach reprodukovali adekvátne modely ľudskej genetickej patológie: dvojitý knockout génu dystrofínu modeluje Duchennovu svalovú dystrofiu u myší a vypnutie génu atm (kontrola syntézy chromatínovej signálnej kinázy) - ataxia-telangiektázia. Pri tomto smrteľnom dedičnom ochorení u detí sa degenerácia Purkyňových buniek v mozočku vyvíja v dôsledku defektov v reparácii DNA, ktorá je sprevádzaná involúciou týmusu v dôsledku smrti proliferujúcich buniek. Klinický obraz, patofyziológia a patomorfológia ataxie-telangiektázie, reprodukovanej zavedením patologickej genetickej informácie do embryonálnych kmeňových buniek (ESC), u chimérnych myší zodpovedajú tým u ľudí. Okrem ataxie-telangiektázie boli s použitím ESC a knockout myší vyvinuté experimentálne modely niektorých dedičných homozygotných ľudských ochorení spojených s patológiou metabolizmu sacharidov a lipidov, katabolizmom aminokyselín a vylučovaním medi a bilirubínu, čo výrazne rozšírilo možnosti experimentálnej medicíny v štádiu predklinického testovania nových metód liečby zodpovedajúcich ľudských ochorení.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]

Použitie cytohybridov kmeňových buniek

Hybridné bunky získané fúziou ESC so somatickými bunkami sú adekvátnym a sľubným modelom na štúdium pluripotencie kmeňových buniek a preprogramovanie chromozómov diferencovaných buniek. Cytohybridy získané fúziou ESC s diferencovanými bunkami dospelého zvieraťa umožňujú študovať vzťahy medzi genómami rôzneho „veku“: jedinečná situácia vzniká, keď sa homológne chromozómy pochádzajúce z buniek v rôznych štádiách diferenciácie a rôznych stupňoch zrelosti nachádzajú v tom istom jadre, kde si môžu ľahko vymieňať trans-akčné regulačné signály. Je ťažké predpovedať, ako budú cisregulačné epigenetické systémy homológnych chromozómov, vytvorené počas individuálneho vývoja, reagovať na vplyv trans-akčných signálov vychádzajúcich z embryonálne príbuzných genómov. Okrem toho v hybridných bunkách dochádza k segregácii rodičovských chromozómov, čo nám umožňuje študovať interakciu genómov na úrovni jednotlivých chromozómov, teda potenciálne identifikovať účasť špecifických chromozómov na udržiavaní pluripotencie alebo naopak, na výstupe z diferenciácie.

Cytohybridy získané fúziou pluripotentného teratokarcinómu a diferencovaných somatických buniek boli použité ako prvý experimentálny model na štúdium interakcie genómov s rôznymi „vývojovými históriami“. V niektorých prípadoch si takéto hybridné bunky zachovali pluripotentné vlastnosti na pomerne vysokej úrovni. Najmä in vivo hybridné bunky teratokarcinómu a somatických buniek indukovali vývoj skutočných teratómov obsahujúcich deriváty všetkých troch zárodočných vrstiev a in vitro v suspenzných kultúrach tvorili embryoidné telieska. Aj v interspecifických cytohybridoch tohto typu bola prítomnosť embryonálnych antigénov zaznamenaná v prípadoch, keď somatickými partnermi pri fúzii s bunkami teratokarcinómu boli lymfocyty alebo tymocyty. Je pozoruhodné, že cytohybridy vytvorené fúziou buniek teratokarcinómu s fibroblastmi zodpovedali fibroblastom fenotypom.

Najdôležitejším zisteným faktom je, že v hybridných bunkách teratokarcinóm-somatika sa objavili známky preprogramovania diferencovaného bunkového genómu, ktoré bolo charakterizované reaktiváciou buď jednotlivých génov, alebo neaktívneho chromozómu X somatického partnera. Výsledky štúdií cytohybridov typu teratokarcinóm-somatika teda naznačujú, že v hybridných bunkách je často zachovaná pluripotencia a existujú známky preprogramovania genómu somatického partnera.

V experimentoch zameraných na získanie intraspecifických embryonálnych hybridných buniek fúziou myších ESC s dospelými splenocytmi boli študované charakteristiky takýchto cytohybridov, analyzovaná bola segregácia rodičovských chromozómov a bola hodnotená pluripotencia hybridného genómu. Intraspecifické hybridné bunky získané fúziou buniek teratokarcinómu so somatickými bunkami sa zvyčajne vyznačujú nízkou úrovňou segregácie chromozómov s tetraploidným alebo takmer tetraploidným karyotypom. Podobné chromozómové zloženie bolo pozorované u cytohybridov počas fúzie primárnych zárodočných buniek s lymfocytmi. Zároveň interspecifické hybridné bunky získané fúziou buniek myšieho teratokarcinómu s norkovými lymfocytmi vykazovali intenzívnu segregáciu chromozómov somatického partnera.

Kvalitatívne nová etapa v štúdiu segregácie rodičovských chromozómov u intraspecifických hybridov sa začala po vývoji metódy analýzy mikrosatelitov pomocou polymerázovej reťazovej reakcie, vďaka ktorej sa pre každý myší chromozóm našlo niekoľko stoviek markerov, čo umožnilo spoľahlivé rozlíšenie akéhokoľvek páru homológnych chromozómov v hybridných bunkách.

Fúziou ESC (bunky HM-1 s deficitom aktivity hypoxantínfosforibozyltransferázy, 2n = 40, XY, izolované z blastocýst myší 129/01a) so splenocytmi kongénnych myší DD/c bolo možné získať sadu hybridných klonov morfologicky podobných ESC. Všetky klony boli izolované na selektívnom médiu, v ktorom môžu rásť iba bunky s aktívnou hypoxantínfosforibozyltransferázou. Elektroforetická analýza ukázala, že všetky klony mali alelický variant hypoxantínfosforibozyltransferázy charakteristický pre myši DD/c. Cytogenetická analýza ukázala, že tri zo štyroch hybridných klonov mali takmer diploidnú sadu chromozómov. Jeden takmer tetraploidný klon obsahoval dve populácie hybridných buniek, z ktorých jedna bola tetraploidná a druhá, menšia, bola diploidná.

Mikrosatelitná analýza, ktorá umožňuje rozlíšenie akéhokoľvek páru homológnych chromozómov myší 129/01a a DD/c v hybridných klonoch s takmer diploidnou sadou, ukázala, že v dvoch klonoch došlo k jasnej preferenčnej eliminácii autozómov somatického partnera. Väčšina autozómov v klonoch HESS2 a HESS3 mala markery línie 129/01a, t. j. pluripotentného partnera. Výnimkou boli chromozómy 1 a I: v klonoch HESS2 a HESS3 boli spolu s markermi buniek HM-1 prítomné v malom množstve aj markery somatického partnera. Takéto výsledky môžu odrážať neúplnú segregáciu chromozómov 1 a I somatického partnera a sú v súlade s cytogenetickými údajmi, že trizómia týchto chromozómov sa pozoruje v 30 – 40 % buniek klonov HESS2 a HESS3. Klon HESS4 sa významne líšil v chromozómovom zložení: mnohé autozómy v tomto klone pochádzali z genómu ESC (chromozómy 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 a 17), ale chromozómy 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 a 19 boli zastúpené homológmi oboch rodičov. Kvantitatívny pomer mikrosatelitov označujúcich tieto homológne chromozómy bol približne 1:1. To umožnilo autorom predpokladať, že jeden homológ pochádza z genómu ESC a druhý z diferencovaných buniek. V niektorých subklonoch klonu HESS4 boli prítomné iba markery chromozómov 18 a 19 somatického partnera. Získané výsledky naznačujú, že v bunkách klonu HESS4 došlo okrem segregácie chromozómov somatického partnera aj k eliminácii jedného alebo oboch homológov vyššie uvedených chromozómov pluripotentného genómu, to znamená, že došlo k bilaterálnej segregácii chromozómov oboch rodičov - veľmi nezvyčajný jav, pretože segregácia chromozómov iba jedného z rodičov je charakteristická pre cytohybridy.

Okrem toho, po 20. pasáži všetky klony hybridných buniek obsahovali iba markery chromozómu X somatického partnera, t. j. chromozóm ESC X bol v klonoch nahradený chromozómom X somatického partnera. Túto dôležitú skutočnosť potvrdzujú aj údaje z in situ hybridizácie s použitím FITC-značenej sondy špecifickej pre myší chromozóm X: pozitívny signál bol detegovaný iba na jednom chromozóme. Treba poznamenať, že v skorších štádiách kultivácie (pred 15. pasážou) podľa cytogenetických údajov mnohé bunky obsahovali dva chromozómy X. Použitie selektívnych médií preto umožňuje manipulovať s chromozómovým zložením hybridných buniek a selektívne vyberať klony nesúce jednotlivé chromozómy somatického partnera na pozadí genómu ESC.

Keďže jedinečnou vlastnosťou cytohybridného genómu je lokalizácia rodičovských genómov v jednom jadre, prirodzene vyvstáva otázka zachovania pluripotentných vlastností embryonálneho genómu v hybridoch ESC-somatických buniek za podmienok jeho úzkeho kontaktu s genómom diferencovanej bunky. Morfologicky boli cytohybridy ESC a somatických buniek podobné rodičovskej línii ESC. Vyhodnotenie pluripotencie ukázalo, že všetky klony s takmer diploidnou sadou chromozómov boli schopné tvoriť embryoidné telieska v suspenzných kultúrach, v ktorých boli prítomné deriváty troch zárodočných vrstiev.

Väčšina hybridných buniek obsahovala antigén ECMA-7, marker charakteristický pre skoré myšie embryá, a mala tiež vysokú aktivitu alkalickej fosfatázy. Najpresvedčivejšie údaje o vysokých pluripotentných vlastnostiach hybridných buniek boli získané v experimentoch so získaním série injekčných chimér zahŕňajúcich hybridné bunky klonu HESS2. Analýza biochemických markerov ukázala, že potomkovia darcovských hybridných buniek boli prítomní vo väčšine tkanív chimér. Hybridné bunky získané fúziou ESC a somatických diferencovaných buniek si preto zachovávajú pluripotenciu na vysokej úrovni vrátane schopnosti tvoriť chiméry po injekcii do dutiny blastocysty.

Klony HESS2 a HESS4 sa významne líšili v zložení rodičovských chromozómov, ale mali podobné pluripotentné vlastnosti. Dalo by sa predpokladať, že pluripotencia v hybridnom genóme sa prejavuje ako dominantný znak, ale je možné, že nie všetky chromozómy embryonálneho genómu sú zapojené do procesu udržiavania pluripotencie. Ak je tento predpoklad správny, potom možno očakávať, že eliminácia niektorých chromozómov pluripotentného partnera z genómu hybridných buniek nebude sprevádzaná zmenou ich pluripotentného stavu. V tomto prípade by nám analýza segregácie rodičovských chromozómov v embryonálnych hybridných bunkách umožnila bližšie sa priblížiť k identifikácii chromozómov zodpovedných za kontrolu pluripotencie embryonálnych buniek.

O. Serov a kol. (2001) nenašli žiadne potomstvo medzi 50 potomkami získanými krížením chimér s normálnymi myšami, ktoré mali myší genotyp 129/01a a niesli chromozóm X myší DD. Autori sa domnievajú, že je to spôsobené znížením pluripotencie v hybridných bunkách pod vplyvom somatického genómu. Alternatívnym vysvetlením môže byť negatívny vplyv trizómie na niektoré autozómy a nerovnováha pohlavných chromozómov (XXY boli pozorované v bunkách až do 15. pasáže) v hybridných bunkách počas meiózy. Je známe, že bunky XXY nie sú schopné podstúpiť meiózu a tvoriť gaméty. Trizómia môže tiež spôsobiť zníženie proliferačnej aktivity hybridných buniek, v dôsledku čoho selektívnu výhodu pri vývoji chimér môžu mať bunky recipientného embrya. Z toho vyplýva, že pre adekvátne posúdenie pluripotentného potenciálu hybridných buniek je potrebné získať hybridné klony s normálnou diploidnou sadou chromozómov.

V experimentoch O. Serova a spoluautorov (2001) bola prvýkrát preukázaná možnosť preprogramovania chromozómu X somatickej bunky v genóme hybridných buniek. Tento záver autorov vyplýva z analýzy expresie génu hprt (marker chromozómu X) u chimér: prítomnosť alelického variantu hprt myší DD/c bola detegovaná vo všetkých analyzovaných chimérických tkanivách. Je vhodné zdôrazniť, že po zavedení hybridných buniek do dutiny blastocysty sa cytohybridy dostávajú do neselektívnych podmienok a zachovanie chromozómu X v genóme hybridných buniek znamená, že sa stal ich obligátnou súčasťou a genóm ho nerozlišuje od chromozómu Y pluripotentného partnera.

Zhrnutím výsledkov analýzy interakcie somatických a pluripotentných genómov v hybridných embryonálnych bunkách autori dospeli k záveru, že u niektorých cytohybridov sa pluripotencia prejavuje ako dominantný znak. Hybridný genóm je schopný preprogramovať jednotlivé chromozómy diferencovaných buniek, čo však nevylučuje možnosť spätného účinku somatického genómu na pluripotenciu embryonálneho genómu. Pri kultivácii hybridných buniek dochádza k indukcii diferenciácie výrazne častejšie ako v pôvodnej rodičovskej línii ESC HM-1. Podobný účinok sa pozoruje aj počas tvorby primárnych kolónií: mnohé primárne kolónie embryonálnych hybridných buniek sa diferencujú v skorých štádiách tvorby s veľkými stratami klonov počas ich selekcie a reprodukcie.

Cytohybridy vytvorené fúziou embryonálnych kmeňových buniek (ESC) so somatickými bunkami si teda napriek úzkemu kontaktu s genómom diferencovaných buniek zachovávajú pluripotenciu ako jedinečnú vlastnosť embryonálneho genómu. Navyše, v takýchto hybridných bunkách je možné preprogramovanie jednotlivých chromozómov pochádzajúcich z diferencovaných buniek. Zostáva nejasné, do akej miery sú pluripotentné vlastnosti embryonálneho genómu zachované v hybridných bunkách, najmä ich schopnosť podieľať sa na tvorbe zárodočnej línie v chimérach. To si vyžaduje získanie embryonálnych hybridných buniek s normálnym karyotypom. V každom prípade sa pluripotentné embryonálne hybridné bunky môžu stať skutočným genetickým modelom na identifikáciu chromozómov zapojených do udržiavania pluripotencie alebo jej kontroly, pretože bilaterálna segregácia rodičovských chromozómov potenciálne poskytuje takúto príležitosť.

Nemenej atraktívne je štúdium javu, ktorý O. Serov a kol. (2001) definujú ako „chromozomálnu pamäť“. V hybridnom genóme sa homológne chromozómy nachádzajú v dvoch alternatívnych konfiguráciách: homológy somatického partnera už raz prešli diferenciáciou, zatiaľ čo v homológoch pluripotentného partnera sa tento proces ešte len začína. Zachovanie vysokých pluripotentných vlastností hybridnými bunkami teda naznačuje, že „pluripotentná“ konfigurácia homológov ESC je v hybridnom genóme dostatočne stabilná napriek vplyvu transakčných faktorov vychádzajúcich zo somatického partnera. Vyššie opísané znaky preprogramovania homológnych chromozómov diferencovaného genómu počas vývoja chimér nevylučujú možnosť, že v prvých štádiách tvorby a kultivácie cytohybridov in vitro si zachovávajú svoj stav získaný počas diferenciácie in vivo. Podľa nedávno získaných údajov, keď sú embryonálne hybridné bunky prenesené do neselektívneho prostredia, vykazujú intenzívnu elimináciu chromozómov iba somatického partnera, t. j. genóm hybridných buniek ľahko rozlišuje homológy po kultivácii in vitro počas 10 – 15 pasáží. Embryonálne hybridné bunky teda predstavujú sľubný experimentálny model na štúdium nielen takej základnej vlastnosti embryonálneho genómu, ako je pluripotencia, ale aj jej alternatívy - embryonálnej diferenciácie.

Terapeutická účinnosť transplantácie embryonálnych kmeňových buniek

Pred analýzou terapeutickej účinnosti transplantácie embryonálnych kmeňových buniek (ESC) a ich derivátov zhrnieme vyššie uvedený materiál. Schopnosti ESC z hľadiska plnej realizácie embryogenézy in vitro sú nedostatočné, pretože vývojové chyby sú v tomto prípade spôsobené absenciou mezenchymálnych kmeňových buniek, ktoré v tele vznikajú autonómne a nezávisle od ESC. Genetický potenciál ESC je menší ako genetický potenciál zygoty, preto sa ESC nepoužívajú priamo na klonovanie embryí. Jedinečný biologický potenciál ESC ako jediných buniek, v ktorých sú vývojové programy plne nasadené v konzistentnej implementácii, sa využíva v štúdiách génových funkcií. Pomocou ESC sa dekódujú prvé kombinácie signálov aktivujúcich expresiu skorých a neskorých génov kódujúcich vývoj troch zárodočných vrstiev. Zachovanie pluripotencie genómu ESC in vitro z nich robí jedinečný nástroj na reparatívnu regeneráciu, schopný automaticky doplniť bunkové straty v prípade poškodenia orgánov a tkanív. V ideálnom hypotetickom scenári možno predpokladať, že „... pri transplantácii darcovských ESC sa do tela príjemcu prenesú kompaktne zbalené programy, ktoré sa za priaznivých podmienok realizujú pri konštrukcii nového tkaniva“7, schopného „... byť efektívne integrované do tela príjemcu na morfologickej aj funkčnej úrovni“.

Prirodzene, po vývoji metód monodiferenciácie embryonálnych kmeňových buniek (ESC) sa začalo in vivo štúdium funkčnej aktivity buniek získaných in vitro z jedného špecializovaného klonu. Proliferujúci klon ESC generuje populácie migrujúcich progenitorových buniek, ktoré sú skutočne schopné aktívne sa integrovať do oblastí poškodenia tkaniva príjemcu, čo sa využíva v regeneratívno-plastickej medicíne. Bolo zistené, že transplantácia neurónov DOPA do substantia nigra znižuje klinické prejavy pri experimentálnom hemiparkinsonizme. Regionálne transplantácie darcovských nervových kmeňových buniek znižujú stupeň motorických porúch spôsobených traumou alebo kontúziou miechy a mozgu. Získali sa aj prvé pozitívne výsledky transplantácie kmeňových buniek pri demyelinizačných ochoreniach. Zdá sa, že regeneratívno-plastický potenciál ESC otvára neobmedzené možnosti využitia bunkovej transplantácie v praktickej medicíne. Pri transplantácii do ektopických zón sa však ESC nevyhnutne transformujú na nádory. Teratómy sa tvoria, keď sa ESC injikujú subkutánne imunodeficientným myšiam. Keď sa suspenzie ESC transplantujú pod kapsulu semenníka u syngénnych myší, tvoria sa aj teratómy pozostávajúce z rôznych tkanív, ktorých bunky sú derivátmi všetkých troch zárodočných vrstiev. V takýchto teratómoch sú procesy zníženej organogenézy extrémne zriedkavé.

Množstvo štúdií poskytuje informácie o pozitívnych výsledkoch transplantácie skorých derivátov embryonálnych kmeňových buniek (ESC) zvieratám s experimentálnou patológiou. Bunková neurotransplantácia s použitím derivátov ESC sa ďalej rozvíja v experimentoch a prvých klinických skúškach na korekciu funkčných porúch pri poraneniach mozgu a miechy a na liečbu syringomyélie a sklerózy multiplex (Repin, 2001). S príchodom techniky in vitro neurogenézy z ESC sa namiesto použitia embryonálneho mozgového tkaniva vyvíjajú metódy transplantácie derivátov neurosféry získaných z embryonálnych kultúr nervového tkaniva. Takéto transplantačné suspenzie sú výrazne homogénnejšie a obsahujú viazané prekurzory neurónov a neuroglií.

Pri pravidelnom pridávaní kyseliny retinovej v dávke 10 μg/ml do kultivačného média počas 6 týždňov sa v línii ľudského embryo-(terato)-karcinómu NTERA-2 vytvorí viac ako 80 % postmitotických neurónov. Úplná homogenita neuronálnej populácie sa dosahuje prietokovým triedením zrelých neurónov označených imunofenotypovými markermi, čo umožňuje zbaviť sa zvyškov teratokarcinómu a nezrelých buniek. Po transplantácii do rôznych oblastí mozgu experimentálnych zvierat takéto neuróny nielen prežijú, ale sa aj integrujú do regionálnych neurónových sietí. U zvierat s experimentálnymi modelmi lokálnych defektov CNS neurotransplantácia znižuje klinické prejavy takých ľudských patológií, ako sú následky traumatického poranenia mozgu, mozgovej príhody, demyelinizačných ochorení, dedičných defektov vo vývoji mozočka, ochorení ukladania lipidov a polysacharidov.

Na optimalizáciu regeneračných procesov pri degeneratívnych ochoreniach centrálneho nervového systému sa vyvíjajú technológie na získavanie myelín produkujúcich oligodendrocytov z embryonálnych kmeňových buniek (ESC). Prvá fáza tradične zahŕňa proliferáciu ESC s reprodukciou počtu buniek potrebných na transplantáciu. V druhej fáze sa vykonáva cielená diferenciácia buniek na populáciu myelín produkujúcich prekurzorov oligodendrocytov, ktorá je riadená selektívnymi markerovými antigénmi.

Otvárajú sa určité perspektívy pre využitie derivátov ESC na vývoj metód korekcie imunodeficiencií spôsobených genetickými poruchami v dozrievaní týmusu. V štúdiách na knockout (rag 1) myšiach s indukovaným génovým defektom - narušením rekombinačného mechanizmu lokusov V(D)J génov TCR, čo vedie k strate funkcie T-lymfocytov, transplantácia skorých derivátov ESC do týmusu zvierat obnovuje dozrievanie normálnych populácií imunitných klonov zodpovedných za bunkovú imunitu. Klinické skúšky transplantácie in vitro preformovaných ESC na liečbu fatálnych dedičných anémií u detí prebiehajú.

Námietky proti rýchlemu zavedeniu transplantácie kmeňových buniek do klinickej praxe sú založené na obmedzenom počte stabilných línií ľudských embryonálnych kmeňových buniek a potrebe ich štandardizácie. Na zvýšenie čistoty štandardizovaných línií ESC, ako aj dospelých ľudských kmeňových buniek, sa navrhuje použiť metódu výberu línií založenú na molekulárno-genetickej analýze krátkych tandemových opakovaní DNA. Je tiež potrebné testovať línie ESC na prítomnosť malých chromozómových prestavieb a genetických mutácií, ktorých potenciál výskytu v podmienkach bunkovej kultúry je pomerne vysoký. Predkladá sa téza o povinnom testovaní vlastností všetkých typov ESC a regionálnych pluripotentných kmeňových buniek, pretože ich reprodukcia in vitro môže viesť k vzniku nových charakteristík, ktoré nie sú vlastné embryonálnym kmeňovým bunkám ani definitívnym tkanivám. Predovšetkým sa predpokladá, že dlhodobá kultivácia v médiu s cytokínmi približuje línie ESC k nádorovým bunkám, pretože prechádzajú podobnými zmenami v dráhach regulácie bunkového cyklu so získaním schopnosti vykonávať neobmedzený počet bunkových delení. Niektorí autori, na základe potenciálu pre rozvoj nádoru, považujú transplantáciu derivátov skorých embryonálnych kmeňových buniek ľuďom za bezohľadnú. Podľa ich názoru je oveľa bezpečnejšie použiť angažovaných potomkov ESC, teda línie diferencovaných bunkových progenitorov. V súčasnosti však ešte nebola vyvinutá spoľahlivá technika na získanie stabilných ľudských bunkových línií, ktoré sa diferencujú požadovaným smerom.

V literatúre sa teda objavuje čoraz viac údajov o pozitívnom terapeutickom účinku transplantácie derivátov ľudských embryonálnych kmeňových buniek. Mnohé z týchto štúdií sú však predmetom preskúmania a kritiky. Niektorí výskumníci sa domnievajú, že výsledky skorých klinických štúdií sú predbežné a naznačujú len to, že kmeňové bunky sú schopné priaznivo ovplyvniť klinický priebeh konkrétneho ochorenia. Preto je potrebné získať údaje o vzdialených výsledkoch bunkovej transplantácie. Ako argument sa uvádzajú štádiá vývoja klinickej neurotransplantológie. V literatúre spočiatku skutočne prevládali publikácie o vysokej účinnosti transplantácie embryonálnych mozgových fragmentov pri Parkinsonovej chorobe, potom sa však začali objavovať správy popierajúce terapeutickú účinnosť embryonálneho alebo fetálneho nervového tkaniva transplantovaného do mozgu pacientov.

Prvé klinické štúdie boli vykonané s cieľom posúdiť bezpečnosť transplantácie neuroblastov odvodených z ESC teratokarcinómu NTERA-2, ktorých nezrelé bunky boli podrobené proliferácii v kultúre až do nahromadenia 100 miliónov bunkovej hmoty. Časť takto získaných buniek bola použitá na charakterizáciu fenotypu a stanovenie bunkových nečistôt, ako aj na testovanie možnej kontaminácie vírusmi a baktériami. LIF a výživná vrstva fetálnych stromálnych buniek boli odstránené z kultivačného média a boli vytvorené podmienky pre cielenú diferenciáciu ESC na neuroblasty pomocou kombinácie cytokínov a rastových faktorov. Následne boli neuroblasty purifikované z nezrelých buniek teratokarcinómu na prietokovom triediči buniek. Po sekundárnej purifikácii a charakterizácii fenotypu transplantovaných buniek bola suspenzia neuroblastov (10 – 12 miliónov) injekčne podaná do bazálneho jadra mozgu pacientov (v siedmom mesiaci po hemoragickej cievnej mozgovej príhode) pomocou špeciálnej mikrokanyly a striekačky pod stereotaktickou a počítačovou tomografiou. Ročný skríning následkov transplantácie neurónov do zóny cievnej mozgovej príhody po transplantácii neodhalil žiadne vedľajšie ani nežiaduce účinky. U polovice pacientov došlo k zlepšeniu motorických funkcií v období od 6 do 12 mesiacov po transplantácii. Pozitívne klinické zmeny boli sprevádzané zvýšeným prekrvením zóny mŕtvice po transplantácii buniek: priemerný nárast absorpcie fluorescenčne značenej 2-deoxyglukózy podľa pozitrónovej emisnej tomografie dosiahol 18 % a u niektorých pacientov 35 %.

Americké Národné inštitúty zdravia (National Institutes of Health) však vykonali nezávislú štúdiu klinickej účinnosti neurotransplantácie u pacientov s Parkinsonovou chorobou. Pacientom v prvej skupine boli transplantované rezy embryonálneho nervového tkaniva, ktoré produkujú dopamín, zatiaľ čo druhá skupina pacientov podstúpila simulovanú operáciu. Výsledky naznačujú nulovú klinickú účinnosť takejto neurotransplantácie, a to aj napriek tomu, že embryonálne neuróny produkujúce dopamín v mozgoch príjemcov prežili. Navyše, 2 roky po transplantácii embryonálneho nervového tkaniva sa u 15 % pacientov vyvinula pretrvávajúca dyskinéza, ktorá u pacientov v skupine s placebom chýbala (Kmeňové bunky: vedecký pokrok a budúce smery výskumu. Národný inštitút zdravia. USA). Pozorovania ďalšieho vývoja ochorenia u týchto pacientov stále prebiehajú.

Niektorí autori spájajú protichodné údaje z literatúry o hodnotení klinickej účinnosti neurotransplantácie s rôznymi prístupmi k výberu skupín pacientov, nedostatočným výberom metód na objektívne posúdenie ich stavu a predovšetkým s rôznymi obdobiami vývoja embryonálneho nervového tkaniva a rôznymi oblasťami mozgu, z ktorých bolo toto tkanivo získané, rôznymi veľkosťami transplantátov a metodologickými znakmi chirurgického zákroku.

Treba poznamenať, že pokusy o priamu transplantáciu pluripotentných embryonálnych kmeňových buniek do oblasti striata v mozgu potkanov s experimentálnym hemiparkinsonizmom boli sprevádzané proliferáciou embryonálnych kmeňových buniek (ESC) a ich diferenciáciou na dopaminergné neuróny. Treba predpokladať, že novovytvorené neuróny boli efektívne integrované do neurónových sietí, pretože po transplantácii ESC sa pozorovala korekcia behaviorálnych anomálií a motorickej asymetrie v apomorfínovom teste. Zároveň niektoré zvieratá uhynuli v dôsledku transformácie transplantovaných ESC na mozgové nádory.

Odborníci z Národnej a lekárskej akadémie USA, špecialisti z Národného inštitútu zdravia USA, sa domnievajú, že klinický potenciál embryonálnych kmeňových buniek (ESC) si zaslúži najvážnejšiu pozornosť, ale trvajú na potrebe podrobného štúdia ich vlastností, pravdepodobnosti komplikácií a dlhodobých následkov v experimentoch na adekvátnych biologických modeloch ľudských ochorení (Kmeňové bunky a budúca regeneratívna medicína, National Academy Press; Kmeňové bunky a budúce smery výskumu. Nat. Inst, of Health USA).

Z tohto hľadiska je dôležité, že porovnávacia histologická analýza experimentálnych teratómov získaných transplantáciou suspenzie ESC do semenníkov s teratómami vytvorenými v dôsledku transplantácie skorého embrya, ktoré tiež obsahuje ESC, ukázala, že ESC, bez ohľadu na ich zdroj pôvodu alebo interakciu s určitými okolitými bunkami, realizujú svoj tumorigénny potenciál rovnakým spôsobom. Bolo dokázané, že takéto teratómy majú klonálny pôvod, pretože nádory pozostávajúce z derivátov všetkých troch zárodočných vrstiev môžu vzniknúť z jednej ESC (Rega, 2001). Je pozoruhodné, že keď boli klonované ESC s normálnym karyotypom transplantované imunodeficientným myšiam, vytvorili sa aj teratómy pozostávajúce z rôznych typov diferencovaných somatických buniek. Tieto experimentálne údaje sú bezchybným dôkazom klonálneho pôvodu teratómov. Z hľadiska vývojovej biológie naznačujú, že ako zdroj diferencovaných derivátov všetkých troch zárodočných vrstiev, ktoré tvoria teratóm, nepôsobí viacero viazaných progenitorových buniek, ale jedna pluripotentná kmeňová bunka. Avšak na ceste k praktickej transplantácii buniek sú výsledky týchto štúdií, ak nie prekážkou, tak varovným signálom potenciálneho nebezpečenstva, pretože inokulácia ESC alebo primordiálnych zárodočných buniek do rôznych tkanív dospelých imunodeficientných myší nevyhnutne spôsobuje vývoj nádorov z transplantovaných kmeňových buniek. Neoplastická degenerácia ektopicky transplantovaných ESC je sprevádzaná vznikom satelitných populácií diferencovaných buniek - v dôsledku čiastočnej diferenciácie ESC a progenitorových klonov do špecializovaných línií. Je zaujímavé, že pri transplantácii ESC do kostrových svalov sa neuróny najčastejšie tvoria vedľa buniek teratokarcinómu. Zavedenie ESC do deliaceho sa vajíčka alebo blastocysty je však sprevádzané úplnou integráciou buniek do embrya bez tvorby neoplastických prvkov. V tomto prípade sú ESC integrované prakticky do všetkých orgánov a tkanív embrya vrátane genitálneho primordia. Takéto alofénové zvieratá boli prvýkrát získané zavedením buniek teratokarcinómu 129 do skorých embryí v štádiách 8-100 buniek. U myší s alofénom sú populácie heterogénnych buniek odvodených z darcovských ESC integrované do tkanív kostnej drene, čreva, kože, pečene a genitálií, čo umožňuje v experimente vytvárať aj medzidruhové bunkové chiméry. Čím kratšie je vývojové obdobie raného embrya, tým vyššie je percento chimerizácie buniek, pričom najvyšší stupeň chimerizácie sa pozoruje v hematopoetickom systéme, koži, nervovom systéme, pečeni a tenkom čreve embrya s alofénom. V dospelom organizme sú tkanivá chránené pred imunitným systémom príjemcu histohematickými bariérami náchylné na chimerizáciu:Transplantácia primárnych zárodočných buniek do testikulárneho parenchýmu je sprevádzaná začlenením darcovských kmeňových buniek do vrstvy zárodočného tkaniva príjemcu. Pri transplantácii ESC do blastocysty však nedochádza k tvorbe chimérických základov pohlavných orgánov s tvorbou darcovských primárnych zárodočných buniek. Pluripotencia ESC sa pri vytvorení špeciálnych podmienok môže využiť aj na klonovanie: transplantácia myších ESC do 8-16-bunkového myšieho embrya, v ktorom sú bunkové mitózy blokované cytokalsínom, podporuje implementáciu normálnej embryogenézy s vývojom embrya z darcovských ESC.

Alternatívou k alogénnej transplantácii ESC je preto terapeutické klonovanie založené na transplantácii jadier somatických buniek do enukleovaného vajíčka za účelom vytvorenia blastocysty, z ktorej vnútornej bunkovej hmoty sa potom izolujú línie ESC geneticky identické s darcom somatického jadra. Technicky je táto myšlienka celkom uskutočniteľná, pretože možnosť vytvorenia línií ESC z blastocyst získaných po transplantácii somatických jadier do enukleovaných vajíčok bola opakovane preukázaná v experimentoch na laboratórnych zvieratách (Nagy, 1990; Munsie, 2000). Najmä u myší homozygotných pre mutáciu génu rag2 boli ako darcovia jadier použité fibroblasty získané kultiváciou buniek subepidermálneho tkaniva, ktoré boli transplantované do enukleovaných oocytov. Po aktivácii oocytov bola „zygota“ kultivovaná až do vzniku blastocysty, z ktorej vnútornej bunkovej hmoty boli izolované ESC a prenesené do línie buniek nulizygotných pre mutantný gén (rag2~/~). Mutácia jedného alelického génu bola v takýchto ESC korigovaná metódou homológnej rekombinácie. V prvej sérii experimentov boli embryoidné telieska získané z ESC s rekombinantným obnoveným génom, ich bunky boli transfekované rekombinantným retrovírusom (HoxB4i/GFP) a po reprodukcii boli injekčne podané do žily myší rag2~/~. V druhej sérii boli tetraploidné blastoméry agregované s geneticky modifikovanými ESC a transplantované do recipientných samíc. Výsledné imunokompetentné myši slúžili ako darcovia kostnej drene na transplantáciu do mutantných myší rag2~/~. V oboch sériách bol výsledok pozitívny: po 3-4 týždňoch boli u všetkých myší nájdené zrelé normálne myeloidné a lymfoidné bunky schopné produkovať imunoglobulíny. Transplantácia jadier somatických buniek do oocytov sa teda môže použiť nielen na získanie línií ESC, ale aj na cytogenoterapiu - korekciu dedičných anomálií s použitím ESC ako vektora na transport korekčnej genetickej informácie. Tento smer bunkovej transplantácie má však okrem bioetických problémov aj svoje obmedzenia. Nie je jasné, aká bezpečná bude transplantácia terapeuticky klonovaných buniek s genotypom identickým s genotypom konkrétneho pacienta, pretože takéto bunky môžu zavádzať mutácie, ktoré vytvárajú predispozíciu k iným ochoreniam. Normálne ľudské vajíčka zostávajú ťažko dostupným objektom, zatiaľ čo aj pri transplantácii somatických jadier do enukleovaných zvieracích vajíčok sa iba 15 – 25 % vytvorených „zygotov“ vyvinie do štádia blastocysty. Zatiaľ nie je určené, koľko blastocyst je potrebných na získanie jednej línie pluripotentných klonovaných ESC. Za zmienku stojí aj vysoká úroveň finančných nákladov spojených so zložitosťou metodiky terapeutického klonovania.

Na záver treba poznamenať, že v ESC je pluripotencia genómu s hypometylovanou DNA kombinovaná s vysokou telomerázovou aktivitou a krátkou C^ fázou bunkového cyklu, čo zabezpečuje ich intenzívnu a potenciálne nekonečnú reprodukciu, počas ktorej si ESC zachovávajú diploidnú sadu chromozómov a „juvenilnú“ sadu fenotypových charakteristík. Klonálny rast ESC v kultúre neinterferuje s ich diferenciáciou na žiadnu špecializovanú bunkovú líniu organizmu, keď je proliferácia zastavená a sú pridané vhodné regulačné signály. Reštrikčná diferenciácia ESC na somatické bunkové línie in vitro sa realizuje bez účasti mezenchýmu, obchádza Nochtey, mimo organogenézy a bez tvorby embrya. Ektopické zavedenie ESC in vivo nevyhnutne vedie k tvorbe teratokarcinómov. Transplantácia ESC do blastocysty alebo skorého embrya je sprevádzaná ich integráciou s embryonálnymi tkanivami a stabilnou chimerizáciou jeho orgánov.

Regeneratívno-plastické technológie založené na transplantácii buniek sú priesečníkom záujmov zástupcov bunkovej biológie, vývojovej biológie, experimentálnej genetiky, imunológie, neurológie, kardiológie, hematológie a mnohých ďalších odvetví experimentálnej a praktickej medicíny. Najdôležitejšie výsledky experimentálnych štúdií dokazujú možnosť preprogramovania kmeňových buniek s cielenou zmenou ich vlastností, čo otvára perspektívy riadenia procesov cytodiferenciácie pomocou rastových faktorov - pre regeneráciu myokardu, obnovu lézií CNS a normalizáciu funkcie ostrovčekového aparátu pankreasu. Pre široké zavedenie transplantácie derivátov ESC do praktickej medicíny je však potrebné podrobnejšie študovať vlastnosti ľudských kmeňových buniek a pokračovať v experimentoch s ESC na experimentálnych modeloch ochorení.

Bioetické otázky a problém odmietnutia alogénneho bunkového transplantátu by sa mohli vyriešiť objavenou plasticitou genómu regionálnych kmeňových buniek dospelého organizmu. Počiatočná informácia, že pri transplantácii izolovaných a starostlivo charakterizovaných hematopoetických autológnych buniek do pečene, z ktorých vznikajú nové hepatocyty, integrujúce sa do pečeňových lalokov, je však v súčasnosti revidovaná a kritizovaná. Napriek tomu boli publikované údaje, že transplantácia nervových kmeňových buniek do týmusu spôsobuje tvorbu nových darcovských T- a B-lymfocytových klíčkov a transplantácia mozgových nervových kmeňových buniek do kostnej drene vedie k tvorbe hematopoetických klíčkov s dlhodobou darcovskou myelo- a erytropoézou. V dôsledku toho môžu v orgánoch dospelého organizmu pretrvávať pluripotentné kmeňové bunky schopné preprogramovať genóm na potenciál embryonálnych kmeňových buniek (ESC).

Zdrojom získavania ESC na lekárske účely zostáva ľudské embryo, čo predurčuje nevyhnutnosť nového prieniku morálnych, etických, právnych a náboženských otázok v mieste vzniku ľudského života. Objav ESC dal silný impulz k obnoveniu náročných diskusií o tom, kde je hranica medzi živými bunkami a hmotou, bytím a osobnosťou. Zároveň neexistujú žiadne univerzálne normy, pravidlá a zákony týkajúce sa používania ESC v medicíne, napriek opakovaným pokusom o ich vytvorenie a prijatie. Každý štát v rámci svojej legislatívy rieši tento problém samostatne. Lekári na celom svete sa naďalej snažia posunúť regeneratívno-plastickú medicínu nad rámec takýchto diskusií, predovšetkým prostredníctvom využívania rezerv dospelých kmeňových buniek namiesto embryonálnych kmeňových buniek.

Trochu histórie izolácie embryonálnych kmeňových buniek

Bunky terato(embryo)karcinómu boli izolované zo spontánne sa vyskytujúcich testikulárnych teratómov myší 129/ter-Sv, spontánnych ovariálnych teratómov myší Lt/Sv a z teratómov odvodených z ektopicky transplantovaných embryonálnych buniek alebo tkanív. Spomedzi stabilných bunkových línií myšieho terato(embryo)karcinómu získaných týmto spôsobom boli niektoré pluripotentné, iné sa diferencovali iba na jeden špecifický typ buniek a niektoré neboli úplne schopné cytodiferenciácie.

V istom období sa pozornosť sústredila na štúdie, ktorých výsledky naznačovali možnosť návratu buniek terato-(embryo)-karcinómu k normálnemu fenotypu po ich zavedení do tkanív vyvíjajúceho sa embrya, ako aj na práce na in vitro tvorbe geneticky modifikovaných buniek terato-(embryo)-karcinómu, s pomocou ktorých boli získané mutantné myši na biologické modelovanie ľudskej dedičnej patológie.

Na izoláciu bunkových línií terato-(embryo)-karcinómu sa použila kultivácia v podmienenej suspenzii. V kultúre bunky terato-(embryo)-karcinómu, podobne ako ESC, rastú za vzniku embryoidných teliesok a vyžadujú si povinnú disociáciu pre prenos do línie, pričom si zachovávajú pluripotenciu na podpôrnej vrstve embryonálnych fibroblastov alebo počas kultivácie v suspenzii v podmienenom médiu. Bunky pluripotentných línií terato-(embryo)-karcinómu sú veľké, guľovité, vyznačujú sa vysokou aktivitou alkalickej fosfatázy, tvoria agregáty a sú schopné viacsmerovej diferenciácie. Po zavedení do blastocysty sa agregujú s morulou, čo vedie k tvorbe chimérických embryí, v zložení ktorých sa nachádzajú deriváty buniek terato-(embryo)-karcinómu. Prevažná väčšina takýchto chimérických embryí však umiera in utero a v orgánoch prežívajúcich novonarodených chimér sa cudzie bunky detegujú zriedkavo a s nízkou hustotou. Zároveň prudko stúpa výskyt nádorov (fibrosarkóm, rabdomyosarkóm, iné typy malígnych nádorov a pankreatický adenóm) a k degenerácii nádoru často dochádza počas obdobia intrauterinného vývoja chimérických embryí.

Väčšina buniek terato-(embryo)-karcinómu v mikroprostredí normálnych embryonálnych buniek takmer prirodzene nadobúda malígne neoplastické vlastnosti. Predpokladá sa, že ireverzibilná malignita je spôsobená aktiváciou protoonkogénov v procese štrukturálnych prestavieb. Jednou z výnimiek sú bunky embryokarcinómovej línie SST3, získané z myších testikulárnych teratómov (línia 129/Sv-ter), ktoré vykazujú vysokú schopnosť integrácie do tkanív a orgánov embrya bez následnej tvorby nádoru u chimérických myší. Deriváty bunkových línií terato-(embryo)-karcinómu u chimérických myší sa prakticky nepodieľajú na tvorbe primárnych gonocytov. Zrejme je to spôsobené vysokou frekvenciou chromozómových aberácií charakteristických pre väčšinu terato-(embryo)-karcinómových línií, v ktorých bunkách sa pozoruje aneuploidia aj chromozómové abnormality.

V laboratórnych podmienkach bolo získaných niekoľko stabilných línií ľudských terato-(embryo)-karcinómových buniek charakterizovaných pluripotenciou, vysokou proliferačnou aktivitou a schopnosťou diferenciácie počas rastu v kultúrach. Konkrétne bola na štúdium mechanizmov neurálnej cytodiferenciácie použitá línia ľudských terato-(embryo)-karcinómových buniek NTERA-2. Po transplantácii buniek tejto línie do subventrikulárnej oblasti predného mozgu novonarodených potkanov bola pozorovaná ich migrácia a neurogenéza. Dokonca sa uskutočnili pokusy o transplantáciu neurónov získaných kultiváciou buniek terato-(embryo)-karcinómovej línie NTERA-2 pacientom s mozgovou príhodou, čo podľa autorov viedlo k zlepšeniu klinického priebehu ochorenia. Zároveň sa u pacientov s mozgovou príhodou nevyskytli žiadne prípady malignity transplantovaných buniek terato-(embryo)-karcinómovej línie NTERA-2.

Prvé línie nediferencovaných pluripotentných myších embryonálnych kmeňových buniek získali začiatkom 80. rokov 20. storočia Evans a Martin, ktorí ich izolovali z vnútornej bunkovej masy blastocysty – embryoblastu. Izolované línie ESC si dlhodobo zachovali pluripotenciu a schopnosť diferencovať sa na rôzne bunkové typy pod vplyvom faktorov v špeciálnom kultivačnom médiu.

Samotný termín „embryonálna pluripotentná kmeňová bunka“ patrí Leroyovi Stevensovi, ktorý pri štúdiu vplyvu tabakového dechtu na výskyt vzniku nádoru upozornil na spontánny výskyt testikulárneho teratokarcinómu u lineárnych (129/v) myší v kontrolnej skupine. Bunky testikulárnych teratokarcinómov sa vyznačovali vysokou mierou proliferácie a v prítomnosti tekutiny z brušnej dutiny sa spontánne diferencovali s tvorbou neurónov, keratinocytov, chondrocytov, kardiomyocytov, ako aj vlasových a kostných fragmentov, ale bez akýchkoľvek známok usporiadanej cytoarchitektúry zodpovedajúceho tkaniva. Po umiestnení do kultúry rástli bunky teratokarcinómu ako pluripotentné klony nepripojené k substrátu a tvorili embryoidné telieska, po ktorých prestali sa deliť a podstúpili spontánnu neusporiadanú diferenciáciu na neuróny, gliové bunky, svalové bunky a kardiomyocyty. Stevens zistil, že myší teratokarcinóm 129/v obsahuje menej ako 1 % buniek schopných diferenciácie do rôznych špecializovaných somatických línií a samotná diferenciácia závisí od faktorov, ktoré ich ovplyvňujú (zloženie peritoneálnej tekutiny, produkty zrelých buniek alebo tkanív pridaných do kultúry). Potvrdila sa hypotéza Leroya Stevensona o prítomnosti embryonálnych progenitorových buniek zárodočnej línie medzi bunkami teratokarcinómu: suspenzia embryoblastových buniek z preimplantačných embryí v tkanivách dospelých myší vytvorila teratokarcinómy a čisté bunkové línie izolované z nich po intraperitoneálnom podaní recipientným zvieratám sa diferencovali na neuróny, kardiomyocyty a ďalšie somatické bunky odvodené zo všetkých troch zárodočných vrstiev. V experimentoch in vivo viedla transplantácia embryonálnych kmeňových buniek (získaných z embryoblastu, ale nie trofoblastu) do myších embryí inej línie v štádiách blastomér 8-32 k narodeniu chimérických zvierat (bez vývoja nádorov), v ktorých orgánoch sa našli klíčky darcovského tkaniva. Chimerizmus sa pozoroval dokonca aj v línii zárodočných buniek.

Primárne progenitorové zárodočné bunky izolované z genitálneho rudimentu myšieho embrya zodpovedali morfológiou, imunologickým fenotypom a funkčnými charakteristikami ESC získaným Stevensonom z teratokarcinómu a embryoblastu. U chimér narodených po zavedení ESC do blastocysty bola alofénová morfogenéza orgánov charakterizovaná mozaikovým striedaním štruktúrnych a funkčných jednotiek darcu a príjemcu - pečene, pľúc a obličiek. V niektorých prípadoch sa pozorovala tvorba črevných krýpt alebo pečeňových lalokov pozostávajúcich z buniek príjemcu aj darcu. Morfogenéza sa však vždy realizovala podľa genetického programu druhu, ku ktorému príjemca patril, a chimerizmus bol obmedzený výlučne na bunkovú úroveň.

Vtedy sa zistilo, že proliferácia embryonálnych kmeňových buniek (ESC) bez cytodiferenciácie na výživnej vrstve buniek odvodených z mezenchýmu (fetálne fibroblasty) prebieha za povinnej prítomnosti LIF v selektívnych živných médiách, ktoré selektívne zabezpečujú prežitie iba kmeňových a progenitorových buniek, zatiaľ čo prevažná väčšina špecializovaných bunkových prvkov odumiera. Pomocou týchto metód v roku 1998 James Thomson izoloval päť imortalizovaných línií embryonálnych kmeňových buniek z vnútornej bunkovej hmoty ľudskej blastocysty. V tom istom roku John Gerhart vyvinul metódu na izoláciu nesmrteľných línií ESC z genitálneho tuberkulu štvor- až päťtýždňových ľudských embryí. Vďaka svojim jedinečným vlastnostiam sa embryonálne kmeňové bunky a kmeňové bunky definitívnych tkanív začali používať v praxi regeneratívnej medicíny a génovej terapie.