Diagnostika herpesu

Diagnóza herpesu je založená na klasickej izolácii vírusu na citlivých bunkových kultúrach, imunofluorescenčných a sérologických metódach, kolposkopickom vyšetrení a použití moderných molekulárno-biologických metód (PCR, dot hybridizácia), ktoré umožňujú diagnostikovať celú skupinu herpesvírusov vrátane typov HHV-6 a HHV-7.

Laboratórne diagnostické metódy pre herpetickú infekciu

Hlavné metódy zamerané na izoláciu HSV alebo detekciu vírusových častíc a/alebo ich zložiek	Pomocné metódy zamerané na detekciu protilátok proti HSV v biologických tekutinách ľudského tela
Izolácia HSV v citlivých bunkových a živočíšnych kultúrach Priama a imunitná elektrónová mikroskopia Priame a nepriame varianty IPA IFA Molekulárne biologické metódy Latexová aglutinačná reakcia	Neutralizačná reakcia RSC Stanovenie protilátok proti neštrukturálnym proteínom HSV-1,2

Ukázalo sa, že u 76 % pacientov je genitálny herpes (GH) spôsobený HSV-2 a u 24 % typom HSV-1. GH sa ako monoinfekcia vyskytol iba u 22 % pacientov, pričom v 78 % prípadov boli zistené mikrobiálne asociácie. U 46 % jedincov bola zistená parazitocenóza spôsobená dvoma patogénmi, vrátane chlamýdií zistených v 40 % prípadov. Gardnerella, Trichomonas a gonokoky boli v náteroch menej často zistené.

U 27 % pacientov bola parazitocenóza zastúpená tromi patogénmi, u 5,2 % štyrmi patogénmi. Najčastejšie sa však pozorovala kombinácia chlamýdií s gardnerelou a hubami Candida. Tieto údaje potvrdzujú potrebu dôkladného bakteriologického vyšetrenia pacientov s GH s cieľom identifikovať kombinácie patogénnych agensov, ako aj hĺbkové štúdium patogenézy zmiešaných infekcií urogenitálneho traktu, čo umožní diferencovanú komplexnú liečbu herpes infekcie.

Materiály študované na izoláciu HSV v závislosti od lokalizácie herpetických lézií

Lokalizácia lézií	Obsah vezikúl	Zoškrabovanie buniek				Mozgovomiechový mok	Bronchiálny aspirát	Biopsia	Krv
		1	2	3	4
Koža	+								+
Oči			+						+
Genitálie				+					+
Riť	+				+				+
Ústa	+	+							+
CNS	+					+		+	+
Pľúca		+					+		+
Pečeň								+	+
Vrodený herpes	+	+	+				+		+

Metódy laboratórnej diagnostiky cytomegalovírusovej infekcie

Metódy	Čas potrebný na dosiahnutie výsledkov	Poznámky
VIROLOGICKÉ
Elektrónová mikroskopia	3 hodiny	Nie veľmi prístupné
Izolácia vírusu v bunkovej kultúre (VCI)	4 – 20 dní	Štandardný, Pomalý
Imunofluorescenčné farbenie skorého štádia AG pomocou monoklonálnych protilátok	6 hodín	Menej špecifické
CYTOLOGICKÉ	2-3 hodiny	Menej špecifické
SÉROLOGICKÉ
RSC	2 dni	Štandard
RGA	1 deň	Náročné na prácu
ÚTES	6 hodín	Jednoduché, konkrétne
NRIF	6 hodín	Ťažké
RIMP	6 hodín	Ťažké
ELISA (IgM, DO)	6 hodín	Rýchle, jednoduché
Imunoblot	6 hodín	Drahé
MOLEKULÁRNE BIOLOGICKÉ
MG	5-7 dní	Drahé, náročné na pracovnú silu
PCR	3 hodiny	Drahé

Metódy diagnostiky vírusu herpes zoster

Diagnostické metódy	Laboratórne techniky
NEPRIAME
Výber	Tkanivové kultúry, kuracie embryá, laboratórne zvieratá, kokultivácia s permisívnymi bunkami alebo pomocnými vírusmi
Identifikácia izolátov	Neutralizačná reakcia, RSC, IF, PIEF, reakcia precipitácie izolátov, aglutinácia, IF
PRIAME
Cytológia	Nátery: farebná imunofluorescencia
Histológia	Patomorfológia bunky
Štruktúra	Embryonálna mikroskopia, imunoelektrónová mikroskopia
Stanovenie antigénov	IF, PIEF, RIM, IFA
Stanovenie lokálnej produkcie protilátok	Ig M, Ig G, Ig A: ELISA, RIA
Molekulárne biologické prístupy	Molekulárna hybridizácia, PCR

Laboratórna diagnostika infekcie spôsobenej vírusom herpes zoster

Diagnostické problémy	Metódy	Očakávané výsledky
Akútna primárna infekcia	1	Detekcia do 2 hodín
	2	Hladiny protilátok pomaly stúpajú
	3	Prejavuje sa 3 dni po infekcii
Akútna reaktivovaná infekcia	1	Detekcia UUU po 2 hodinách
	2	Hladiny protilátok pomaly stúpajú
	4	Objavuje sa 4 dni po objavení sa vyrážky

1. stanovenie vezikúl VEGF v kvapaline;
2. sérológia: CSC, ELISA, zameraná na detekciu
3. sérológia: ELISA zameraná na detekciu IgM;
4. sérológia: ELISA zameraná na detekciu IgA, IgM.

Metódy na indikáciu imunitnej odpovede na infekciu vírusom herpes zoster

Prístup	Metóda
Detekcia zvýšenia titra protilátok v druhom sére	RSK, RTGA, RPGA, IF neutralizačná reakcia, RIM, ELISA
Detekcia protilátok špecifických pre triedu Ig G a Ig A v prvej vzorke séra	ELISA, IF, RIM, latexová aglutinácia

Interpretácia výsledkov sérologického vyšetrenia sér pacientov na infekcie herpesvírusom (ELISA)

Názov infekcie/markera	Priemerné prahové hodnoty pre infekcie
	Výsledky analýzy	Interpretácia
Cytomegália Anti-CMV IgG (1-20 U/ml) Anti-CMV IgM (100 – 300 %)	Pozitívny 1-6 Pozitívny 6-10 Pozitívny >10 Negatívny Pozitívny 100-300 Negatívny <90 Pochybný 90-100	Remisia Exacerbácia ochorenia Akútna fáza ochorenia Žiadna infekcia (ochorenie) Akútna fáza ochorenia Analýzu zopakujte o 2 – 3 týždne
Herpes simplex 1, 2 sérotypy Anti-HSV 1/2 celkovo (100 – 900 %)	Pozitívny 100 – 400 Pozitívny 400 – 800 Pozitívny > 800 Negatívny < 100	Remisia Exacerbácia ochorenia Akútna fáza ochorenia Žiadna infekcia (ochorenie)

Tabuľka uvádza hlavné metódy laboratórnej diagnostiky herpesvírusových infekcií, ako aj odporúčané biologické materiály, ktoré sa vyšetrujú pri izolácii HSV, berúc do úvahy lokalizáciu herpetických lézií.

Spoľahlivá izolácia vírusov herpes simplex a CMV infekciou citlivých bunkových kultúr. Počas virologického vyšetrenia 26 pacientov počas obdobia relapsu bol teda HSV izolovaný na citlivej bunkovej kultúre Vero v 23 prípadoch (88,4 %). Infikované kultúry vykazovali obraz cytopatického účinku typického pre HSV - tvorbu viacjadrových obrovských buniek alebo akumuláciu zaoblených a zväčšených buniek vo forme zhlukov. V 52,1 % prípadov bolo možné ložiská cytopatického účinku vírusu detegovať už 16 – 24 hodín po infekcii. Po 48 – 72 hodinách inkubácie infikovaných kultúr sa percento materiálov spôsobujúcich špecifickú deštrukciu buniek zvýšilo na 87 %. A iba v 13 % prípadov boli pozitívne výsledky detegované 96 hodín po infekcii alebo neskôr alebo počas opakovaného pasážovania.

Metódy laboratórnej diagnostiky generalizovanej herpesovej infekcie

Hlavné metódy zamerané na detekciu (izoláciu) herpesvírusov, ich častíc a ich zložiek	Pomocné metódy zamerané na detekciu protilátok proti herpesvírusom v biologických tekutinách, detekcia enzymatických posunov v krvnom sére
Izolácia herpesvírusov na citlivých bunkových a živočíšnych kultúrach Priama a imunitná elektrónová mikroskopia Priame a nepriame varianty imunoperoxidázovej metódy Priame a nepriame varianty fluorescenčnej protilátkovej metódy Varianty enzýmovej imunoanalýzy na pevnej fáze Varianty molekulárnej (DNA-DNA) hybridizačnej metódy Polymerázová reťazová reakcia Latexová aglutinačná reakcia	Neutralizačný test Test fixácie komplementu Latexový aglutinačný test Nepriama verzia metódy fluorescenčných protilátok Nepriama verzia imunoperoxidázovej metódy Varianty enzýmovo-imunoanalýzy na pevnej fáze Metóda imunitného blottingu Metóda radiálnej fixácie komplementu Stanovenie hladín alanín a aspartátaminotransferázy

Na diagnostiku infekčnej mononukleózy (infekcie spôsobenej EBV) sa používajú sérologické metódy. Používa sa Paulova-Bunnelova reakcia s baraními erytrocytmi, diagnostický titer 1:28 alebo vyšší v jednom teste krvného séra alebo 4-násobné zvýšenie protilátok pri vyšetrení párových sér. Používa sa Hoffova-Bauerova reakcia so 4 % suspenziou formalinizovaných konských erytrocytov. Výsledok sa berie do úvahy po 2 minútach; pri infekčnej mononukleóze je reakcia vysoko špecifická.

V súčasnosti sa vyvíja metóda enzýmovej imunoanalýzy (EIA) na diagnostiku infekčnej mononukleózy. V tomto prípade sa protilátky IgG a IgM v sére pacienta stanovujú inkubáciou s lymfoblastmi infikovanými EBV, po ktorej nasleduje liečba fluorescenčnými protilátkami. V akútnom období ochorenia sa protilátky proti kapsidovému antigénu vírusu stanovujú v titri 1:160 a vyššom.

Pri použití viacerých dovážaných komerčných testovacích systémov dokáže ELISA detegovať: protilátky proti obalovým protilátkam EBV, protilátky proti skorému antigénu EBV, celkové protilátky proti skorému antigénu EBV, stanovené v akútnej fáze ochorenia v jadre aj v cytoplazme bunky, a obmedzené protilátky proti skorému antigénu EBV, stanovené v akútnej fáze ochorenia v jadre aj v cytoplazme bunky, obmedzené protilátky proti skorému antigénu EBV, stanovené na vrchole ochorenia iba v cytoplazme bunky, a protilátky proti jadrovému antigénu EBV. Použitie týchto testovacích systémov umožňuje diferenciálnu diagnostiku viacerých ochorení spojených s EBV.

Po pozitívnom ELISA teste, ktorý odhalí protilátky proti EBV, sa vykoná potvrdzujúca imunoblotingová reakcia, ktorá určí prítomnosť protilátok proti jednotlivým markerovým proteínom EBV (p-proteínom): p23, p54, p72 (prítomnosť tohto proteínu naznačuje možnosť reprodukcie EBV), p 138. Vyššie uvedené laboratórne metódy sa používajú aj na monitorovanie účinnosti liečby.

Citlivosť virologických metód je 85 – 100 %, špecificita je 100 %, doba štúdie je 2 – 5 dní. V praxi sa často používa metóda priamej imunofluorescencie (DIF) s polyklonálnymi alebo monoklonálnymi protilátkami proti HSV-1 a HSV-2. Metóda DIF je pomerne ľahko reprodukovateľná v bežnom klinickom laboratóriu, nie je drahá, citlivosť je nad 80 %, špecificita je 90 – 95 %. Imunofluorescenčná mikroskopia odhalila prítomnosť cytoplazmatických inklúzií, morfologické znaky, percento infikovaných buniek v náteroch – šrapnoch z močovej rúry, krčka maternice, krčka maternice a konečníka.

Metóda PIF poskytuje predstavu o morfologických vlastnostiach buniek a zmenách v lokalizácii antigénov HSV. Okrem priamych znakov poškodenia buniek herpesvírusmi (detekcia špecifickej luminiscencie) existujú podľa údajov PIF aj nepriame znaky herpetickej infekcie:

• agregácia jadrovej hmoty, oddelenie karyolemmy;
• prítomnosť tzv. „dierok“ jadier, keď z bunkového jadra zostáva iba jedna karyolemma;
• prítomnosť intranukleárnych inklúzií - Cowdryho teliesok.

Pri vykonávaní PIF lekár získa nielen kvalitatívne, ale aj kvantitatívne hodnotenie stavu infikovaných buniek, ktoré sme použili na posúdenie účinnosti antivírusovej liečby acyklovirom (AC). Metódou PIF bolo teda v dynamike vyšetrených 80 pacientov s jednoduchým genitálnym herpesom (GH). Ukázalo sa, že ak pred liečbou acyklovirom malo 88 % pacientov vysoké percento infikovaných buniek (50 – 75 % a viac) v náteroch, potom po jednej kúre acykloviru boli zdravé bunky zistené v náteroch u 44 % pacientov, v 31 % prípadov boli zaznamenané jednotlivé infikované bunky a u 25 % pacientov bolo infikovaných buniek až 10 %.

Obsah infikovaných buniek v náteroch (PIF reakcia) u pacientov s genitálnym herpesom liečených acyklovirom

Obdobia choroby	Percentuálny obsah v náteroch
	Infikované bunky					Normálne bunky
	Viac ako 75 %	50 – 75 %	40 – 50 %	10 %	Jednotlivé bunky v zornom poli
Recidíva (pred liečbou)	25 %	63 %	12 %
	(20)	(50)	(10)
Remisia (po liečbe)				25 %	31 %	44 %
				(20)	(25)	(35)

Pri použití PIF a metódy bodkovej hybridizácie po mnoho rokov sa zistilo, že výsledky štúdie sa zhodujú takmer v 100 % prípadov. Treba poznamenať, že na zvýšenie spoľahlivosti diagnózy herpesu, najmä v prípadoch subklinických a málo manifestných foriem herpesu, sa odporúča použiť v práci 2 – 3 metódy laboratórnej diagnostiky, najmä pri vyšetrení tehotných žien, žien s nepriaznivou pôrodníckou anamnézou a osôb s nešpecifikovanou gynekologickou diagnózou.

Pri PCR diagnostike vírusových a bakteriálnych infekcií urogenitálneho traktu je teda potrebné vyhodnotiť získané pozitívne výsledky s ohľadom na anamnézu, prítomnosť (alebo neprítomnosť) špecifických klinických príznakov ochorenia. Ak sa pomocou PCR zistia chlamýdie, potom je v tomto prípade vysoká pravdepodobnosť infekcie a otázky liečby sa môžu podľa toho vyriešiť. V prípade detekcie mykoplaziem (ureaplazmy), ktoré sú oportúnnymi mikroorganizmami, sú na potvrdenie diagnózy potrebné ďalšie kultivačné štúdie, t. j. výsev materiálu od pacienta na citlivé bunkové kultúry. Iba ak sa v kultivačnej analýze dosiahnu pozitívne výsledky, môžeme hovoriť o laboratórnom potvrdení diagnózy mykoplazmózy. Tá istá metóda umožní v prípade potreby určiť citlivosť izolovaných mykoplaziem na často používané liekové formy (antibiotiká, fluorochinolóny atď.).

Súčasná infekcia viacerými vírusmi z čeľade Herpesviridae je možná. Často sme u jedného pacienta zistili infekciu vírusmi HSV-1, HSV-2 a CMV. Pacienti s klinickými a laboratórnymi prejavmi sekundárneho IDS (onkohematologickí, onkologickí, HIV-infikovaní pacienti) boli významne častejšie infikovaní viacerými herpesvírusmi. Ukázalo sa teda, že klinické a imunologické poruchy progredujúce pri HIV infekcii sú sprevádzané zvýšením počtu herpesvírusov detegovaných metódou molekulárnej hybridizácie. V tomto prípade možno za prognosticky najvýznamnejšiu považovať komplexnú súčasnú detekciu DNA typu HSV-1, CMV a HHV-6.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]