Použitie bunkových technológií na zlepšenie vzhľadu jaziev

Moderná veda sa vyznačuje rýchlym rozvojom množstva súvisiacich disciplín, zjednotených pod všeobecným názvom „biotechnológia“. Táto časť vedy, založená na najnovších úspechoch v oblasti biológie, cytológie, molekulárnej genetiky, genetického inžinierstva a transplantológie, sa zameriava na využitie obrovského potenciálu, ktorý je vlastný rastlinným a živočíšnym bunkám – základným štrukturálnym jednotkám všetkých živých organizmov. „Živá bunka je hotový biotechnologický reaktor, v ktorom sa realizujú nielen procesy vedúce k tvorbe konečného produktu, ale aj množstvo ďalších, ktoré pomáhajú udržiavať katalytickú aktivitu systému na vysokej úrovni,“ – John Woodward, 1992. Začiatok bunkovej vedy bol položený v roku 1665, keď anglický fyzik R. Hooke vytvoril prvý mikroskop a objavil bunky – celuly („bunky“) v korku. V roku 1829 M. Schleiden a T. Schwann zdôvodnili „bunkovú teóriu“, ktorá dokázala, že všetky živé organizmy pozostávajú z buniek. V roku 1858 R. Virchow dokázal, že všetky choroby sú založené na porušení štrukturálnej organizácie a metabolizmu buniek. Stal sa zakladateľom „bunkovej patológie“. Zásadný príspevok k vede o bunke urobili v rokoch 1907-1911 R. Harrison a A. A. Maximov, ktorí dokázali možnosť kultivácie buniek mimo tela. Ich práca ukázala, že na kultiváciu buniek musia byť živočíšne tkanivá a časti rastlín mechanicky oddelené na malé kúsky. Na izoláciu buniek sa tkanivá režú ostrým nožom alebo mikrotómom na tenké rezy, približne 0,5-1,0 mm. Fyzikálne oddelenie buniek sa nazýva imobilizácia. Izolované bunky sa získavajú enzymatickou disperziou kúskov rastlín alebo tkanív. Po rozomletí ostrými nožnicami sa kúsky ošetria trypsínom alebo kolagenázou, čím sa získa suspenzia - suspenzia jednotlivých buniek alebo ich mikroagregátov v špeciálnom médiu. Na imobilizáciu rastlinných buniek sa široko používajú alginátové gély (alginát vápenatý). Bolo dokázané, že imobilizované rastlinné a živočíšne bunky si zachovávajú schopnosť biosyntézy. Produkty bunkovej biosyntézy sa hromadia v bunkách, ich expresia prebieha buď spontánne, alebo pomocou špeciálnych látok, ktoré podporujú zvýšenú priepustnosť bunkových membrán.

Kultivácia živočíšnych buniek je oveľa zložitejší proces ako kultivácia rastlinných buniek, ktorý si vyžaduje špeciálne moderné vybavenie, špičkové technológie, prítomnosť rôznych médií, rastových faktorov určených na zachovanie životaschopnosti buniek a ich udržanie v stave vysokej funkčnej aktivity. Zistilo sa, že väčšina buniek pevných tkanív, ako sú tkanivá obličiek, pečene a kože, je povrchovo závislá, takže ich možno kultivovať in vitro iba vo forme tenkých fólií alebo monovrstiev priamo spojených s povrchom substrátu. Životnosť, proliferácia a funkčná stabilita buniek získaných enzymatickou disperziou tkanív do značnej miery závisia od substrátu, na ktorom sa pestujú. Je známe, že všetky bunky získané z tkanív stavovcov majú negatívny povrchový náboj, takže na ich imobilizáciu sú vhodné kladne nabité substráty. Izolované bunky získané priamo z celých tkanív je možné udržiavať v primárnej kultúre v imobilizovanom stave pri zachovaní vysokej špecificity a citlivosti počas 10 – 14 dní. Imobilizované, povrchovo závislé bunky zohrávajú dnes významnú úlohu v biológii, najmä v klinickom výskume. Používajú sa na štúdium cyklov vývoja buniek, regulácie ich rastu a diferenciácie, funkčných a morfologických rozdielov medzi normálnymi a nádorovými bunkami. Imobilizované bunkové monovrstvy sa používajú v biotestoch, na kvantitatívne stanovenie biologicky aktívnych látok, ako aj na štúdium účinku rôznych liekov a toxínov na ne. Lekári všetkých odborov prejavujú veľký záujem o bunku ako terapeutické činidlo už desaťročia. Bunkové technológie sa v súčasnosti týmto smerom rýchlo rozvíjajú.

Začiatok tkanivovej a bunkovej terapie sa spája s menom slávneho ruského vedca V. P. Filatova, ktorý v roku 1913 položil základy doktríny tkanivovej terapie, pričom študoval výsledky transplantácií rohovky od zdravých darcov pacientom s kataraktou. Pri práci s transplantátmi rohovky zistil, že rohovka uchovávaná v chlade 1-3 dni pri teplote -2-4 stupne Celzia sa lepšie uchytáva ako čerstvá. Takto bola objavená vlastnosť buniek vylučovať v nepriaznivých podmienkach niektoré látky, ktoré stimulujú životne dôležité procesy v transplantovaných tkanivách a regeneračné v tkanivách príjemcu. Tkanivá a bunky oddelené od tela sú v stave stresu, teda spomalenej životne dôležitej činnosti. Krvný obeh v nich sa zastaví, a teda aj výživa. Dýchanie tkanív je extrémne ťažké, inervácia a trofizmus sú narušené. Bunky, ktoré sa nachádzajú v novom kvalitatívnom stave a prispôsobujú sa novým podmienkam existencie, produkujú špeciálne látky s liečivými vlastnosťami. Tieto látky neproteínovej povahy V. P. Filatov nazval biogénnymi stimulantmi. Spolu s V. V. Skorodinskou zistil, že materiál zo zvierat a rastlín sa môže voľne autoklávovať pri teplote 120 stupňov Celzia počas jednej hodiny po uchovávaní v nepriaznivých podmienkach a nielenže nestratil aktivitu, ale naopak ju zvýšil, čo sa vysvetľovalo uvoľňovaním biologických stimulantov z konzervovaných tkanív. Okrem toho stratil antigénne vlastnosti, čo výrazne znížilo možnosť odmietnutia. Konzervovaný sterilný materiál sa do tela zavádzal implantáciou (plantáciou) pod kožu alebo vo forme injekcií extraktov s adekvátnymi výsledkami. Zistilo sa tiež, že fetálne tkanivá obsahujú výrazne väčšie množstvo biologicky aktívnych látok ako tkanivá dospelých jedincov a niektoré faktory sa nachádzajú iba v embryách. Naočkované fetálne tkanivá nie sú organizmom príjemcu vnímané ako cudzie kvôli absencii proteínov zodpovedných za druhovú, tkanivovú a individuálnu špecifickosť (proteíny hlavného histokompatibilného komplexu) v cytoplazmatických membránach. V dôsledku toho naočkovanie živočíšnych fetálnych tkanív do ľudského organizmu nespúšťa mechanizmy imunitnej ochrany a reakcie nekompatibility a odmietnutia. V. P. Filatov vo svojej lekárskej praxi hojne používal ľudskú placentu a kožu. Liečebné kúry pozostávali z 30 – 45 injekcií tkanivových extraktov a 1 – 2 implantácií autoklávovaných tkanív.

Keďže svoj výskum začal s ľudskými a živočíšnymi tkanivami a bunkami, svoje zovšeobecnenia preniesol do rastlinného sveta. Vykonával experimenty so živými časťami rastlín (aloe, skorocel, agáve, vňať repy, ľubovník bodkovaný atď.) a vytvoril pre ne nepriaznivé podmienky, pričom narezané listy umiestnil na tmavé miesto, pretože rastlina pre svoje životné funkcie potrebuje svetlo. Biogénne stimulanty izoloval aj z bahna a rašeliny ústia rieky, pretože bahno a rašelina sa tvoria za účasti mikroflóry a mikrofauny.

Tkanivová terapia sa dočkala nového kola svojho vývoja koncom 70. rokov, keď vedomosti a skúsenosti nahromadené počas desaťročí umožnili využitie živočíšnych a rastlinných tkanív a buniek na kvalitatívne novej úrovni na liečbu ľudí a predĺženie ich aktívnej dlhovekosti. V niektorých domácich a mnohých zahraničných klinikách sa tak ženy vo fyziologickej menopauze s klimakterickým syndrómom alebo na pozadí ovariektómie začali podstupovať tkanivovú terapiu fetálnymi tkanivami placenty, hypotalamu, pečene, vaječníkov, týmusu a štítnej žľazy s cieľom spomaliť proces starnutia, rozvoj aterosklerózy, osteoporózy, dysfunkcií imunitného, endokrinného a nervového systému. V jednej z najprestížnejších gerontokozmetologických kliník v západnej Európe sa na rovnaké účely už niekoľko desaťročí používajú injekcie extraktov získaných z fetálnych tkanív pohlavných žliaz baranov.

V našej krajine našla široké uplatnenie aj biostimulačná liečba. Donedávna sa pacientom s rôznymi ochoreniami aktívne predpisovali injekcie extraktov z placenty, aloe, kalanchoe, rozchodníka veľkého (biosed), FiBS, peloidného destilátu, peloidínu, rašeliny, humisolu pripraveného podľa metódy V. P. Filatova. V súčasnosti je takmer nemožné kúpiť tieto vysoko účinné a lacné domáce tkanivové preparáty živočíšneho, rastlinného a minerálneho pôvodu v lekárňach.

Základom pre získanie rôznych biogénnych prípravkov z ľudských tkanív a orgánov dovážanej výroby, ako je rumalon (z chrupavkového tkaniva a kostnej drene), aktovegin (z teľacej krvi), solkoseryl (extrakt z dobytka), ako aj domácich prípravkov - sklovec (zo sklovca oka hovädzieho dobytka), kerakol (z rohovky hovädzieho dobytka), splenín (zo sleziny hovädzieho dobytka), epitalamín (z epitalamo-epifyzeálnej oblasti), je tiež výskum V. P. Filatova. Zjednocujúcou vlastnosťou všetkých tkanivových prípravkov je celkový účinok na celé telo ako celok. „Tkaninková terapia“ akademika V. P. Filatova tak tvorila základ pre väčšinu moderných vývojov a smerov v chirurgii, imunológii, pôrodníctve a gynekológii, gerontológii, kombustiológii, dermatológii a kozmetológii, ktoré sa týkajú bunky a produktov jej biosyntézy.

Problém transplantácie tkanív znepokojuje ľudstvo už od staroveku. Takto sa v Ebersovom papyruse z roku 8 000 pred Kristom už spomína použitie transplantácie tkanív na kompenzáciu defektov v jednotlivých oblastiach tela. V „Knihe života“ indického vedca Sushrutu, ktorý žil 1 000 rokov pred Kristom, je podrobný opis obnovy nosa z kože líc a čela.

Potreba darcovskej kože rástla úmerne s nárastom počtu plastických a rekonštrukčných operácií. V tomto ohľade sa začala používať koža z kadaverov a plodov. Bolo potrebné zachovať zdroje darcov a nájsť spôsoby, ako nahradiť ľudskú kožu živočíšnymi tkanivami, a rôzne možnosti modelovania kože. A práve týmto smerom pracovali vedci, keď v roku 1941 P. Medovar prvýkrát preukázal zásadnú možnosť rastu keratinocytov in vitro. Ďalšou dôležitou etapou vo vývoji bunkových technológií bola práca Karaseka M. a Charltona M., ktorí v roku 1971 vykonali prvú úspešnú transplantáciu autológnych keratinocytov z primárnej kultúry na rany králika s použitím kolagénového gélu ako substrátu na kultiváciu CC, čo zlepšilo proliferáciu buniek v kultúre. J. Rheinvvald, H. Green vyvinuli technológiu sériovej kultivácie veľkého množstva ľudských keratinocytov. V roku 1979 Green a jeho spoluautori objavili možnosti terapeutického využitia bunkovej kultúry keratinocytov pri obnove kože v prípadoch rozsiahlych popálenín, po čom túto techniku, ktorá sa neustále zdokonaľuje, začali používať chirurgovia v popáleninových centrách v zahraničí aj v našej krajine.

V procese štúdia živých buniek sa zistilo, že bunky produkujú nielen biogénne stimulátory neproteínového pôvodu, ale aj množstvo cytokínov, mediátorov, rastových faktorov, polypeptidov, ktoré hrajú dôležitú úlohu v regulácii homeostázy celého organizmu. Zistilo sa, že rôzne bunky a tkanivá obsahujú peptidové bioregulátory, ktoré majú široké spektrum biologického účinku a koordinujú procesy vývoja a fungovania mnohobunkových systémov. Začala sa éra používania bunkovej kultúry ako terapeutického činidla. V našej krajine sa v posledných desaťročiach v kombustiológii uplatňuje transplantácia suspenzie fibroblastov a viacvrstvových keratinocytových bunkových vrstiev. Takýto aktívny záujem o transplantáciu kožných buniek pacientom s popáleninami sa vysvetľuje potrebou rýchleho uzavretia veľkých popáleninových plôch a nedostatkom darcovskej kože. Možnosť izolácie buniek z malého kúska kože schopného pokryť povrch rany 1000 alebo dokonca 10 000-krát väčší ako plocha darcovskej kože sa ukázala ako veľmi atraktívna a dôležitá pre kombustiológiu a pacientov s popáleninami. Percento uchytenia keratinocytovej vrstvy sa líši v závislosti od oblasti popáleniny, veku a zdravotného stavu pacienta od 71,5 do 93,6 %. Záujem o transplantáciu keratinocytov a fibroblastov sa spája nielen s možnosťou rýchleho uzavretia kožného defektu, ale aj so skutočnosťou, že tieto transplantáty majú silný biologicky aktívny potenciál na zlepšenie vzhľadu tkanív získaných v dôsledku transplantácie. Tvorba nových ciev, úľava od hypoxie, zlepšený trofizmus, zrýchlené dozrievanie nezrelého tkaniva - to je morfofunkčný základ týchto pozitívnych zmien, ku ktorým dochádza v dôsledku uvoľňovania rastových faktorov a cytokínov transplantovanými bunkami. Vďaka zavedeniu progresívnych bunkových technológií transplantácie viacbunkových vrstiev autológnych a alogénnych keratinocytov a fibroblastov na rozsiahle povrchy rán do lekárskej praxe sa kombustiológom podarilo nielen znížiť úmrtnosť obetí popálenín s vysokým percentom kožných lézií, ale aj kvalitatívne zlepšiť jazvové tkanivo, ktoré nevyhnutne vzniká v mieste popálenín stupňa IIb, IIIa a b. Skúsenosti combustiológov získané pri liečbe rán u pacientov s popáleninami naznačili myšlienku použitia už modifikovanej Greenovej metódy v dermatochirurgickej praxi pri rôznych kožných a kozmetických patológiách (trofické vredy, vitiligo, névy, bulózna epidermolýza, odstraňovanie tetovania, vekom podmienené kožné zmeny a na zlepšenie vzhľadu jaziev).

Použitie alogénnych keratinocytov v chirurgii, kombustiológii a dermatokozmetológii má oproti použitiu autológnych keratinocytov množstvo výhod, pretože bunkový materiál je možné vopred pripraviť v neobmedzenom množstve, konzervovať a v prípade potreby použiť. Je tiež známe, že alogénne keratinocyty majú zníženú antigénnu aktivitu, pretože pri kultivácii in vitro strácajú Langerhansove bunky, ktoré sú nosičmi antigénov HLA komplexu. Použitie alogénnych keratinocytov podporuje aj fakt, že po transplantácii sú podľa rôznych autorov nahradené autológnymi v priebehu 10 dní až 3 mesiacov. V tejto súvislosti boli dnes v mnohých krajinách vytvorené bunkové banky, vďaka ktorým je možné získať bunkové transplantáty v požadovanom množstve a v správnom čase. Takéto banky existujú v Nemecku, USA a Japonsku.

Záujem o využitie bunkových technológií v dermatokozmetológii je spôsobený tým, že „bunkové kompozície“ nesú silný bioenergetický a informačný potenciál, vďaka ktorému je možné dosiahnuť kvalitatívne nové výsledky liečby. Autokiny vylučované transplantovanými bunkami (rastové faktory, cytokíny, oxid dusnatý atď.) pôsobia primárne na vlastné fibroblasty tela, čím zvyšujú ich syntetickú a proliferačnú aktivitu. Táto skutočnosť je obzvlášť atraktívna pre výskumníkov, pretože fibroblast je kľúčovou bunkou dermy, ktorej funkčná aktivita určuje stav všetkých vrstiev kože. Je tiež známe, že po poranení kože kauterizáciou, laserom, ihlou a inými nástrojmi sa koža dopĺňa čerstvými kmeňovými prekurzormi fibroblastov z kostnej drene, tukového tkaniva a kapilárnych pericytov, čo prispieva k „omladeniu“ zásoby telesných buniek. Tie aktívne začnú syntetizovať kolagén, elastín, enzýmy, glykozaminoglykány, rastové faktory a ďalšie biologicky aktívne molekuly, čo vedie k zvýšenej hydratácii a vaskularizácii dermy, zlepšuje jej pevnosť,